第二章 微生物的纯培养和显微技术(1)

2、衰退的原因 ①基因突变，②分离现象 3、防止菌种衰退的方法 采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而 言，通常采用稳定的单核孢子进行接种） 选择合适的培养条件 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的 错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用 良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数） 采用有效的菌种保藏方法
稀释摇管法（shake tube method)
用于分离严格厌氧菌。试管培养基融化 50 ℃ 保温 样品梯度稀释后加入试管培养基中 摇 匀冷却凝固 石蜡油封闭 培养。
特点：严格厌氧菌分离技术； 适用缺乏专业设备的情况 局限：观察和挑取菌落难
三、用液体培养基获得纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。
第二章
微生物的纯培养及显微技术
Microbial Pure Cluture & The Microscopic Technique
第一节 微生物的分离和培养
在研究中所使用的微生物培养群体：
培养物（Cluture）：在一定条件下培养、繁殖得到的微 生物群体 混合培养物（Mixed Cluture）：含多种微生物的培养物； 纯培养物（Pure Cluture）：只有一种微生物的培养物；
二元培养物
• 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 • 混合培养物：含有两种以上微生物的培养 物。 • 二元培养物：只含两种微生物且有意识地 保持二者之间特定关系的培养物。 病毒和宿主细胞
六、微生物的保藏技术
影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异 b）污染 c）死亡 基本要求： 在一定时间内使菌种不杂、不乱、不衰、不退
培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成
肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体
众多菌落连成一片
菌苔（lawn）
各种微生物形成的菌落特征
同一细菌在不同培养基上形成不同菌落特征
平板分离微生物纯培养技术（原理及方法） • 稀释倒平板法 • 涂布平板法 • 平板划线法 • 稀释摇管法
1、稀释倒平板法（倾注平板法 pour plate method）
七、菌种的衰退与复壮
1、菌种的衰退 • 衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程 中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生 产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌 种的衰退。 • 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子 越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱；代谢 产物生产能力或其对宿主寄生能力下降等
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（95%
以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。
四、显微单细胞（单孢子）分离法
适合混合菌中的少数菌；
一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；
操作难度与细胞或个体大小成反比
•毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微 生物。
•显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢 子以获得纯培养。 •小液滴法：将经适当稀释后的样品制成小液滴，在显 微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物分离
基本原理： 菌种：优良纯种（最好是休眠体） 手段：低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等 环境：生长受到抑制，难以突变
1、传代培养保藏法 • 是微生物保存的基本方法。 • 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。
• 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存
• 4-6℃保存。
斜面低温保藏法
原理：低温
改良方法：橡皮塞 取代棉塞、加矿油
明视野显微镜 明视野显微镜即常用的普通光学显微镜， 生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的， 不易看清。 解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造 ，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细 胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面 进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜 ，适用于不同的观察目的。
2、富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制 定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛 生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够 更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物
• 如果要从环境中分离得到仅能够利用苯作为碳源 和能源的微生物纯培养物，你该如何设计实验方 案？ （1）富含苯采样 （2）十倍稀释 （3）培养（富集或直接筛选） （4）对照培养（利用空气中的CO2的自养型微生物）
通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果
纯培养技术是进行微生物学研究的基础！
• 无菌技术 • 用固体培养基分离纯培养 • 用液体培养基分离纯培养
• 单细胞（单孢子）分离
• 选择培养分离 • 微生物的保藏技术
一、无菌技术
在分离、转接及培养纯培养(物)时 防止其被其他微生物污染的技术。 用于分离、培养微生物的器皿事先不含任何微 生物； 幻灯片 5 在转接、培养微生物室防止其他微生物的污染；
4、 菌种的复壮（rejuvenation） 使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通 过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群 体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典 型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有 意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工 作，以期菌种的生产性能逐步提高。
一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。
3、砂土管保藏法（干燥-载体保藏） 原理：干燥、缺氧 方法：取河砂若干，24目过筛10%HCl浸泡24h水 洗至中性烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞灭菌 无菌检查每管加孢子悬液，接种环拌匀干燥器 中干燥火焰熔封或蜡封干燥器中保藏 说明： 适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌 时间2—10年 一般细菌芽孢常用砂土管保藏，霉菌的孢子多用麸 皮管保藏。
五、选择培养分离
当微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化 抑制大多数其他微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；
使待分离的微生物在群落中数量上升，方便 用稀释法对其进行纯化 使待分离的微生物生长“突出”
直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养
1、利用选择平板进行直接分离
高温条件下 分离高温菌 ； 培养基添加 抗生素，分 离抗性菌； 培养基中不 含N，分离固 氮菌
4、液氮超低温保藏法（冷冻保藏法） 原理：低温 方法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超 低温冰箱中（ -196℃）。 优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法。 缺点：专门的设备；运输过程比较麻烦；操作要求
5、真空冷冻干燥法 原理：低温、干燥、真空（缺氧） 方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下 快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的 水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。 常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖 优点：适用各种微生物；便于大量保藏；可避免污染 变异率低；菌种存活时间长（几到几十年） 缺点：操作过程复杂，需要一定的专业设备
几种常用菌种保藏方法的比较
国内外菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、
菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱 以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
由复杂的透镜组构成。
二、实验原理 显微镜的放大倍数：物镜放大倍数×目镜放大倍数
机械 装置
聚光器
光学 装置
聚光器透镜 虹彩光圈 升降螺旋
显微镜使用的方法 原因分析
现象
视野内 没有物 像
可能原因
要观察的标本不在视野内
解决办法
调整玻片位置
物镜头与玻片标本间的距离大 重新调节焦距 于或小于低（高）倍镜的工作 距离 标本太小 需用推进器反复找 或更换标本 标本的颜色浅或透明 调节聚光镜或光圈， 使视野变暗
无菌水、梯度稀释、50-55℃左右的琼脂培养基、灭过菌的培养 皿。注意要稀释得当。 分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。
十倍稀释法
优点：适合分离和计数目的
局限：操作麻烦； 不合适热敏感菌； 不适合严格好氧菌； 同一微生物，培养基内外形成菌落形态差异
2、涂布平板法（spread plate method）

无菌水、梯度稀释 涂布平板 Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile glass rod。
优点：简单易行；常规用法 局限：涂布不均与； 易造成机械损伤
稀 释 倒 平 板 法 & 涂 布 平 板 法
• 显微镜的种类及原理 • 显微观察样品的制备
一、显微镜的种类及原理
• 普通光学显微镜 • 暗视野显微镜 • 相差显微镜 • 荧光显微镜 • 透射电子显微镜 • 扫描电子显微镜 • 扫描隧道显微镜
Leabharlann Baidu
光学显微镜
原理 利用物镜和目镜的多组凸透镜将物象逐渐 放大并放射到视网膜的过程
分辨率

肉眼分辨率一般只有0.25mm 光学显微镜分辨率0.18μm 电子显微镜可达0.2nm
3、平板划线法（streak plate method）
An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.
划线方法
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至 生长完全4℃冰箱保藏每隔一段时间移接一次 优点：适用于各种微生物；简便易行；易于观察； 缺点：保藏时间短；传代次数多；易变异；易污染、 保藏时间： 霉 4个月 酵 4—6个月 放 3个月 细 1—2个月
2、石蜡油封藏法 原理：低温、缺氧 方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管 内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱保藏。 说明： 保藏时间1—2年； 斜面培养基能干燥则保藏效果好； 适于各种微生物，尤其适合丝状真菌和担子菌 能同化和敏感烃类的微生物不宜用此法。
4、厌氧微生物的分离
厌氧罐
厌氧手套箱
密封容器除氧方法 生物方法 与需氧微生物共同培养 物理方法 抽气法——将培养物置真空干燥器中抽真空，再 培养。 充气法——把培养物放一密闭贮器中充入N2（排 尽空气）
化学方法 化学吸氧法——利用化学反应耗氧达到形成厌氧环 境的目的。 用焦性没食子酸（1g）与NaOH（10%）反应除氧（ 100ml空气中的O2）。 密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境 NaHSO3+NaCO3混和反应耗氧 培养基预还原法 培养基中加入还原剂（半胱氨酸、Na2S、Vc）再隔 绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。
其自身不污染操作环境
1、微生物培养的常用器具：试管、三角瓶、培养皿等
2、保持无菌的方法
• 高压蒸气灭菌（最常见）
• 高温干热灭菌
• 棉塞
• 超净工作台
• 无菌接种
高压灭菌锅
接种操作 火焰（酒精灯等）附近
超净工作台
二、用固体培养基获得纯培养
菌落（cloney）
单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体

d=0.5λ /ｎsinα Ｒ（１／ｄ） 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对 物镜镜口的张角），ｎsinα =镜口率
介质 折射率 空气 1 水 1.33 香柏油 1.515 α溴萘 1.66
普通生物显微镜由三部分构成： 机械装置：保证光学系统的准确配制，用于固 定材料和观察方便。 照明系统：包括光源和聚光器。 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜 的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都
• 菌种的复壮措施： 纯种分离（平板划线法、涂布法、倾注法、单细 胞挑取法等） 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进 行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体） 采用有效的菌种保藏方法
第二节 显微镜的种类及显微技术 （了解）