第12章免疫组织化学技术
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生物素-亲合素法
葡萄球菌蛋白A 法
亲和组织 化学技术
凝集素法
链霉亲合素 -生物 素法
生物素-亲合素法
亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术 (avidin-biotinperoxidase complex technique,ABC) :按一定比例将亲合素 与酶标生物素结合.形成可溶性亲合素-生物素-过氧化物酶 复合物(ABC)。当其与检测反应体系中的生物素化抗体( 直接法,图12-4)或生物素化第二抗体(间接法)相遇时, ABC中末饱和的亲合素结合部位即可与抗体上的生物素结合 ,使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。
凝集素法
凝集素(lectin)可采用直接法和间接法进行细胞化学染 色。
直接法:将标记物直接结合在凝集素上,使其与组织细 胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。
间接法:先将凝集素与组织细胞膜糖基结合,然后再用 标记的抗凝集素抗体(即用凝集素免疫动物制备抗凝集素抗 体)与结合在细胞上的凝集素反应。
链霉亲合素-生物素法
二氨基联苯胺(DAB) 氨基乙基卡巴唑(AEC)
4-氯-1-萘酚 α-萘酚磷酸盐+快蓝 α-萘酚磷酸盐+快红 溴氯羟吲哚磷酸盐 (BCIP)+氮蓝四唑
(NBT)
颜色
棕色 橘红色 灰蓝色 深蓝色 红色
紫蓝色
第二节 荧光免疫组织化学技术
定义
采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针,检测 待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体),形成的抗原抗 体复合物上带有荧光素,在荧光显微镜下,可以分辨出抗原 (或抗体)所在位置及性质,并可利用荧光定量技术计算其 含量,以实现抗原(或抗体)定位、定性和定量测定的目的 。
酶标记抗体源自文库疫组织化学染色
直接法:将酶直接标记在特异性抗体上,与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应,形成抗原-抗体-酶复合物,最 后用酶底物显色。
间接法:将酶标记在第二抗体上,先将第一抗体(特异 性抗体)与相应的组织抗原结合,形成抗原抗体复合物,再 用第二抗体(酶标记的抗体)与复合物中的特异性抗体结合 ,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色 。
)处理除去类脂。
标本的固定与保存
制片方法的评价:
- 冰冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。 - 为了使抗原达到最大限度的保存,首选的制片方法是冰冻切片。其操作简便
,可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失,适用于不稳 定的抗原。 - 石蜡切片是研究形态学的主要制片方法,它不但是观察组织细胞结构的理想 方法,而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。切片薄而有连 续性,可长期保存,但对抗原的保存不如冰冻切片。
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择: 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体,根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释: 抗原抗体反应要求有合适的比例,过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 : 在保存抗体时,要特别注意保持抗体的生物活性,防止抗体 蛋白质变性。
酶桥法
图12-1 酶免疫组织化学(酶桥法)原理示意图
非标记抗体酶免疫组织化学染色
过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)法:是在酶桥法基础 上加以改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体(抗酶抗体) 与酶组成可溶性复合物(PAP复合物,图12-2)。该复合物 由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成,呈五角形结构, 非常稳定。
免疫组织化学技术的拓展
(一)荧光激活细胞分类仪(FACS) (二)共聚焦显微镜技术 (三)免疫组织化学—显微切割技术
第六节 影响免疫组织化学技术的 主要因素
标本的处理
活体组织
各种体液 及穿刺液
标本的 主要来源
培养细胞
标本的固定与保存
标本固定的目的:
- 使细胞内蛋白质凝固,细胞内分解酶反应终止,以防止细胞自溶,保持细胞 形态和结构。
酶免疫组织化学技术 荧光免疫组织化学技术 免疫金(银)组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫标记电镜组织化学技术
免疫组织化学的基本过程包括: 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体以及抗体的纯化 将标记物与抗体结合形成标记抗体 标本的处理与制备 抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应 观察结果
ABC直接法
图12-4 亲和组织化学(ABC直接法)原理示意图
生物素-亲合素法
桥联亲合素-生物素技术(bridged avidin-biotin technique, BRAB) :该技术不同于ABC法,是以游离的亲合素作为桥联 剂,利用亲合素的多价性,将检测反应体系中抗原、生物素 化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)联结起来,达 到检测反应分子的目的。
第一节 酶免疫组织化学技术
定义:在一定条件下,应用酶标抗体(抗原)与组织或 细胞标本中的抗原(抗体)发生反应,催化底物产生显色反 应,通过显微镜观察标本中抗原(抗体)的分布位置和性质, 也可通过图像分析技术达到定量的目的。
标本类型:有组织切片、组织印片和细胞涂片等。 酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标 记抗体酶免疫组化技术两种类型。
组织处理
标本类型:
涂片和印片 组织切片:冷冻切片;石蜡切片 细胞培养标本 活细胞染色
标本的保存:
标本在固定干燥后,最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如 必须保存时,则应保持干燥,置4℃以下保存。但病毒和某 些组织抗原标本抗原性丧失很快,数天后就失去其抗原性, 需在-20℃以下保存。
阴性结果及抗原不表达 : 阴性结果不能简单地认为具有否定意义,因为阳性表达有强 弱、多少之分,哪怕只有少数细胞阳性(只要是在抗原所在 部位)也应视为阳性表达。 特异性和非特异性显色的鉴别: 根据分布位置和显色强度等进行鉴别。 免疫组化结果与HE切片结果: 当免疫组化检查结果与HE切片诊断不一致时,应综合分析 ,不能简单地用免疫组化结果推翻HE切片诊断。
免疫标记电镜技术标本制备要求
在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强,在取材方面 ,免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、更精细。
在免疫染色方面,又分为包埋前染色、包埋后染色和超 薄切片染色三种。
常用的免疫标记电镜技术
免疫胶体金染色法 免疫胶体铁细胞化学染色法 酶免疫电镜技术
第五节 免疫组织化学技术的临床应用
生物素-亲合素法
标记生物素-抗生物素技术(labelled avidin-biotin technique ,LAB) :以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体 连接进行检测。
该法具有相当高的灵敏度,由于省略了加标记生物素步 骤,操作较BRAB法简便。间接LAB法采用的是生物素化的第 二抗体,可以进一步提高检测灵敏度。
免疫组化的结果判断
对照的设立: 阳性对照。 阴性对照。 其他:空白、替代、吸收或阻断试验均为确证试验。 阳性结果: 阳性细胞的显色可位于细胞质、细胞核和细胞膜表面。免疫 组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量,可作为定性、 定位和定量的依据。阳性细胞可呈散在、灶性和弥漫性分布 。
免疫组化的结果判断
- 保存组织细胞抗原性。 - 防止标本脱落。 - 除去妨碍抗体结合的类脂,便于保存。 - 抑制组织中细菌的繁殖,防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成
分的改变。
标本的固定与保存
固定剂的选择:
- 蛋白质类抗原,可用乙醇或甲醇固定。 - 微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定。 - 如需除去病毒的蛋白质外壳,可使用胰蛋白酶。 - 多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定。 - 如有粘液物质存在,应用透明质酸酶等处理除去。 - 类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时,需用有机溶剂(乙醚、丙酮等
质量控制
试剂质量控制: 抗体的质量;合适的稀释度、稀释剂、孵育温度和孵育时间等 。 操作过程质量控制: 包括实验操作和标本的质量控制。 技术设备、仪器和器具的质量控制: 需定期对相关设备、仪器(含基本实验液体)和器具进行校准 。操作相关工具如吸管、试管、加样枪等需进行消毒。
链霉亲合素(streptavidin,SA)是从链霉菌培养物提取的 一种纯蛋白,不含糖基,有4个生物素结合位点,并且具有 高度的亲和力,其功能类似亲和素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就构 成了酶标链霉亲合素-生物素方法(labelled streptavidin biotin technique,LSAB)。
碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)法:用碱性磷酸酶 代替HRP建立的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)—抗碱 性磷酸酶(AAP)法,即简称APAAP。其技术要点与PAP法相 似。
酶免疫组织化学染色中的常用酶及显色底物:
酶
辣根过氧化物酶 (HRP)
碱性磷酸酶 (AP)
底物
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物(如胶体金、铁蛋白等 )标记抗体,或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体,在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原(抗体)进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ,免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确,可定 位至细胞膜、细胞器,在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
荧光抗体的标记及染色
常用于荧光免疫组织化学技术的荧光素包括异硫氰酸荧 光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白( phycoerythrin, PE)等。荧光抗体的标记及纯化详见第四章 。
根据染色方法的不同,荧光免疫组织化学技术可区分为 直接法和间接法。荧光抗体染色的结果一般用“-”或“+”表示 。染色及结果判读详见第八章 。
通过桥抗体(第二抗体),将特异性识别组织抗原的第 一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来,此时要求特异性 第一抗体与第三抗体的动物种属相同(图12-3)。
PAP法
图12-2 PAP复合物
图12-3 酶免疫组织化学( PAP法)原理示意图
非标记抗体酶免疫组织化学染色
双桥PAP法:该法建立在PAP法的基础上。其基本原理 是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来 的,通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上,以增 强敏感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色比较
直接法
优点 缺点
操作简便 特异性强
敏感性低 制备的抗体种类有限
间接法
检测敏感性高 制备一种酶标二抗可用 于检测多种抗原或抗体
特异性不如直接法 操作较为繁琐
非标记抗体酶免疫组织化学染色
酶桥法:抗酶抗体作为第三抗体,通过桥抗体(第二抗 体),将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起 来,形成酶联的抗原-抗体复合物,加底物显色(图12-1)。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术(immunohistochemistry technique)又 称免疫细胞化学技术,是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同,免疫组织化学技术可分为:
免疫组织化学技术的临床应用
荧光免疫组织化学技术的应用:
1. 在自身免疫性疾病中的应用 2. 细菌和病毒的快速鉴定 3. 寄生虫的检测与研究
酶免疫组织化学技术的应用:
1. 提高病理诊断准确性 2. 癌基因蛋白的临床应用 3. 对肿瘤细胞增生程度的评价 4. 发现微小转移灶 5. 在肿瘤分期上的意义 6. 指导肿瘤的治疗
第三节 亲和组织化学技术
定义
一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(lectin)、 生物素(biotin)和葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein, SPA)等,对某种组织成分具有高亲和力的特点,可以与标记 物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,采用荧 光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜 ,在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定 量分析。
葡萄球菌蛋白A法
根据SPA能与多种动物IgG的Fc段结合的原理,用SPA标 记物(酶、荧光素、放射性物质等)显示抗原与抗体结合反 应的免疫检测实验。
SPA具有和人及多种动物如豚鼠、兔、猪、犬、小鼠、猴 等IgG结合的能力,可解决不同动物样本检测时,需分别标记 相对应的二抗的问题。SPA结合部位是Fc段,这种结合不会影 响抗体的活性。