电镜超薄切片

戊二醛最终浓度 1 2.5 4
调节固定液PH值到7.3-7.4
缺点①不能固定糖元和核酸，对微管固定较 差。②扩散慢，穿透能力差。③具有挥发性 和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。
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B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2） 纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分
装。存放时间久了容易变质，影响固定。 优点 (1)对组织穿透力强。(2)能保存某
重蒸水
加到500ml
调PH到7.4
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0.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液
重蒸水
25ml
二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O）
0. 1mol/L盐酸
8ml
重蒸水
加至50ml
调PH到7.4
2.14g
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B 固定液的配制
锇酸固定液的配制
2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿--1G 锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。
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3）常用的几种固定剂 A 四氧化锇（osmium tetroxide,OsO4）
亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水 溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.51g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒 性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有 刺激作用，在通风橱内径相配制。
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优点①对蛋白质和脂类固定较好。②对作为 细胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，对核蛋白 保护作用很好，因为在有机体内核酸和碳水 化合物与蛋白制成复合的形式，因此锇酸几 乎和所有的细胞成分结合。③分子密度高， 产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到 生物染色作用。
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3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬 浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的 固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固 定
处理后再离心成团， 在50oC中弃去上清液， 加入适量的经50oC 预温的2%的琼浆， 使团悬浮，将悬浮团 和琼脂液一同在薄片 上展层，固定后 切成1mm3的小块。
的组织，一般单独用1-2%四氧化锇固定液 固定1-2小时可达到固定的目地。 B 双固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）---锇 酸（1% 4oC 2h）。 C 原位固定和灌注固定：将动物麻醉、解 剖进行原位固定。灌注固定：通过血液循 环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神 经组织、视网膜、肾脏。
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现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：
一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄 切片和负染色法；
另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷 冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫 电镜法、放射自显影技术、X线微区分析技 术等。
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1、 超薄切片样品的制备 （1） 取材 基本要求是在活体情况下进行 取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则） 1） 快速：1分钟之内投入固定液。 2） 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。 3） 部位准 4） 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，
0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液 配制的1%锇酸固定液。
2%的锇酸缓冲液 0.2mol/L缓冲液 应为7.3-7.4
10ml 10ml 调节PH
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戊二醛固定液的配制
25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6
重蒸水（ml）
4.6 4 3.4
0.2ml/L缓冲液（ml） 5 5 5
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附 几种常见固定剂的配制
固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水 较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值 在7.0以下。
0. 2mol/L磷酸缓冲液的配制
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）
2.6g
磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）
29g
些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有 较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保 存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研 究。
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C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂 配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对 酶的活性保存好。
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2）固定的方法 A 单固定法：对单细胞或固定液易于浸透
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（2）固定 固定的目地是把细胞在活体状态时的结
构尽可能完整的保存下来，避免自身酶的分 解而出现自溶，或外界微生物的侵入而产生 腐败，致细胞的超微结构破坏。
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1）固定液的作用
A．阻止细胞自溶。 B 稳定细胞物质成分。 C 在一些组分的分子之间以化学反应和
物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳 定各种细胞的空间结构。 D能提供一定的电子反差
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理想的固定剂，应具备以下条件：①能 迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细 胞内各种成分；②能即刻将细胞“杀死”， 尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化； ③对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生 人工假象及变形；④可保存酶的活性，以 利于细胞化学测定工作的进行。
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2）影响固定效果的因素 固定液的酸碱度(pH值) ①固定液的pH值 ②渗透压 ③缓冲液的类型 ④固定的温度和时间 当前采用的是在0～4℃下固定1 ～ 4小时。
防止组织受机械损伤。 5） 低温：0-4oC
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取材的方法 1）动物材ຫໍສະໝຸດ Baidu：
对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待 组织适当硬化后再取材。
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胚胎干细胞的研究
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2）培养细胞： 生长在瓶中的细胞到足够的 量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛 固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或 用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混 合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20 分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固 定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固 定、待用。
透射电子显微镜生物制品制备技术
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超薄切片 冷冻蚀刻法
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冷冻蚀刻法 冷冻割断术
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细胞化学法
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免疫组织化学技术 免疫电镜法
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电镜放射自显影术 放射自显影技术
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扫描电镜技术
被 吞 噬 的 红 细 胞