酪蛋白的制备

（3）加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用 95%乙醇洗涤产品。 （4） 乳糖成脎试验 取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管 中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂，摇匀，试管 口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇， 加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结 晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形 态，可证实为乳糖。 ①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触 及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。（选做） （5）旋光法测定含量（选做） 见资料中nunai
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考 马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值 与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测 定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室 温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立， 试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵 敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量， 测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常 用的微量蛋白质快速测定方法。
4．计算酪蛋白的质量浓度和得 率
准确称量从牛奶中分离出的酷蛋白纯品。 (1)计算酪蛋白实际的质量浓度 实际质量浓度以1L，牛奶中酪蛋白的质 量(g)表示。 (2)计算得率 酪蛋白得率／％＝酪蛋白实际的质量浓度 /酪蛋白的理论质量浓度×100 式中：牛奶中酪蛋白的理论质量浓度为35g/L
5．酪蛋白纯度测定 － 考马斯亮蓝法
1 000µg／mL标准蛋 白液（mL） 蒸馏水（mL）
0
0.0 2 0.9 8 5
0.0 4 0.9 6 5
0.0 6 0.9 4 5
0.0 8 0.9 2 5
0.1 0 0.9 0 5
1.0 0 5
考马斯亮蓝G-250试 剂（mL） 蛋白质含量（µg）
0
20
40
60
80
100
OD595nm
（2）0~1 000µg／mL标准曲线的制作：另取6 支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同 （1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000µg／ mL的标准曲线。 表2 高浓度标准曲线制作
大自然中的钙是以化合态存在的，只有被动、 植物吸收后形成具有生物活性的钙，才能更 好地被人体所吸收利用。牛奶中含有丰富的 活性钙，是人类最好的钙源之一，1升新鲜牛 奶所含活性钙约1250毫克，居众多食物之首， 约是大米的101倍、瘦牛肉的75倍、瘦猪肉的 110倍，它不但含量高，而且牛奶中的乳糖能 促进人体肠壁对钙的吸收，吸收率高达98%， 从而调节体内钙的代谢，维持血清钙浓度， 增进骨骼的钙化。吸收好对于补钙是尤其关 键的。故"牛奶能补钙"这一说法是有其科学 道理的。
6、酪蛋白沉淀用200目的尼龙布过滤比较好, 同时进行抽滤。用滤纸很难过滤;而用纱布过 滤,酪蛋白容易粘在其上。 7、用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀时,应将 酪蛋白捣碎,并在溶剂中搅拌、浸泡,充分洗净 脂肪。纯净的酪蛋白应为白色,若发黄表明脂 肪未洗干净。
七、思考题
1.在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调 pH到4.8？ 2.乙醚、乙醇作用是什么？
蛋白。牛奶中的蛋白质便是全蛋白。 牛奶中的无机盐也称矿物质。牛奶中含有 Ca2+、Mg2+、K+、Fe3+等阳离子和PO43-、 SO42-、Cl-等阴离子；此外还有微量元素I、 Cu、Zn、Mn等。这些元素绝大部分都对人体 发育生长和代谢调节起着重要作用。钙是人 体中含量最高的无机盐，是构成骨骼和牙齿 的主要成分。人体中90%的钙集中在牙齿和 骨骼上。儿童、青少年生长发育需要充足的 钙，同样孕妇及成人、中老年人，也需要补 充钙质，缺乏钙会影响牙齿和骨骼的正常发 育，导致佝偻病。
（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴 2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转 移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵， 洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以 充分提取，然后在4 000r/min离心20min，弃 去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏 水定容至刻度，即得待测样品提取液。
三、实验材料、主要仪器和试剂 实验材料、
1． 实验材料 牛奶、200目的尼龙布 2．主要仪器：离心机、、离心管、水浴锅、 pH计、具塞试管、试管架、烧杯、量筒、微 量取样器、分光光度计
3．试剂：0.2 mol/L HAc-Na buffer、95%乙 醇、乙醚、 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确 称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水 中，即为1 000µg／mL的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制： 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％ 乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最 后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下 可放置一个月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％）
1．标准曲线制作 （1）0~100µg／mL标准曲线的制作：取6支 10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后， 将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后 用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记 录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管 号 1 2 3 4 5 6
一、实验目的
1．从牛乳中提取奶油、酪蛋白及乳糖。 2．对酪蛋白进行纯化。 3．掌握考马斯亮蓝法测定含量 4．掌握SDS-PAGE法测定酪蛋白分子量。
二、实验原理
牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质主要是 酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸 钙-磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为20～800纳 米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白 会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加 酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。再 通过离心而获得的沉淀即为酪蛋白，沉淀物中所含的 脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶 状酪蛋白。剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋 白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳清中糖类的 99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。
滤干
20mL乙醇
洗涤 滤纸烘干
洗涤（脂肪完毕）
微搅动 20mL乙醚
带
称重
计算。60°C,4h
式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质 含量（μg）。
六、注意事项
1、牛奶与缓冲液要预热 2、缓冲液要缓加缓搅 3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得搅 破滤纸 4、实验环境要保持空气流通，门窗要开 5、酪蛋白等电点随温度不同而变化,等 电点pH为4.6～4.8。分离酪蛋白时,边加醋酸 边搅拌,边测pH,同时观察沉淀。开始快搅拌, 接近等电点时,应慢搅拌。
表3 待测液蛋白质浓度测定
管
号
13 0.1 0.9 5
14 0.1 0.9 5
蛋白质待测样品提取 液（mL） 蒸馏水（mL） 考马斯亮蓝G-250试 剂（mL） OD595nm 蛋白质含量（µg）
五、结果计算
提取液总体积 （mL） X × 测定时取样体积 （mL） 样品蛋白质含量（µg / g 鲜重）= 样品鲜重（g）
（3）纯化： 用水洗沉淀2次；向沉淀中加入20ml左右的水 (用玻棒将沉淀充分打碎)，离心5min(5000r ／min)，弃去上清液。 用乙醇、无水乙醚洗涤沉淀：在沉淀中加入 20mL 95％乙醇，搅拌片刻(尽可能充分地把 沉淀块状打碎)，将全部悬蚀浓转移至布氏漏 斗中抽滤。用无水乙醇—无水乙醚混合液 （等体积）洗沉淀2次，抽干。最后用无水乙 醚洗沉淀2次，抽干。 (4)将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪 蛋白纯品。
实验五
从牛奶中分离奶油、 从牛奶中分离奶油、酪 蛋白和乳糖
牛奶的化学成分很复杂，至少有100多种，主要成 分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等 组成。一般牛奶的主要化学成分含量为： 水分：87.5% 脂肪：3.5% 蛋白质：3.4% 乳糖：4.6% 无机盐：0.7% 组成人体蛋白质的氨基酸有20种，其中有8种是 人体本身不能合成的，这些氨基酸称为必需氨基 酸。我们进食的蛋白质中如果包含了所有的必需 氨基酸，这种蛋白质便叫作全
四、操作步骤
1．奶油的制备： 牛奶中的脂肪含量在3．4％～3．8％之间， 以极微小微明的小球悬浮于乳的液体内，由 于比重小，一般都聚集在奶的表层。 （1）从牛奶中分离生奶油：取80ml鲜奶，离 心后取出上层奶油。奶油放入冰箱。 （2）24小时后从冰箱中取出奶油，搅打观察 其变化并记录。
2．酪蛋白的制备：
（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表 取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入 具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光 径比色杯在595nm下比色，记录光密度 OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取 液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1 号试管做空白。
（1）取10mL脱脂牛奶加热到40℃，倒人50ml 离心管中，在搅拌下慢慢加入预热到40℃、 PH4．6的o．2mo1／L乙酸—乙酸钠缓冲液 10mL、用pH试纸或酸度计检验，混合物的最 后PH应是4．7。 （2）将上述悬浮液冷却至室温，离心 5min(5000r／min)。弃去上清液，得酯蛋白 粗制品(沉淀物)。
3. 从牛奶中分离乳糖
牛奶中的乳糖含量为4．5％，是乳中的特有 产物。 （1）在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3 的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热 时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。 （2）过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸 石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇 （注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀 后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必 须澄清。
管 号 7 8 9 10 11 12
1 000µg／mL标准蛋白液 （mL） 蒸馏水（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.00
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250试剂 （mL） 蛋白质含量（µg）
5
5
5
5
5
5
0
200
400
600
800
1 000
OD595nm
2．样品提取液中蛋白质浓度的测 定
10mL牛奶
预热
40°C 40°C预热的醋酸buffer 10mL
调pH至4.7 沉淀 得沉淀 漏斗过滤
Байду номын сангаас
室温冷却
离心得
边加边搅拌 5000r/min 于离心管内悬浮 5min 离心 4mL H2O 5000r/min 于离心管内去脂肪 5min 5min 20mL乙醇乙醚混合液（1:1）
20mL乙醇