血红蛋白凝胶过滤层析
血红蛋白凝胶过滤层析
摘要：本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
关键词:凝胶柱，抗凝血，磷酸缓冲溶液
凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析或排阻层析。目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。以Sephadex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离，通过层析柱可以形象的看见分离的过程。
1、实验材料及试验方法
1.1实验仪器：烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、
PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸
1.2实验试剂
（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：称取 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用时现配）。
（4）Sephadex G－25，或G-75
（5）固体铁氰化钾〔K3Fe（CN）6〕
（6）抗凝血（哺乳动物血样，以1：6的比例加入2.5%柠檬酸钠，置于4℃冰箱中保存）。
1.3实验方法
（1）凝胶溶胀（该步骤有老师在实验前准备）
（2）装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入层析柱中，同时开启螺旋夹，控制一定流速。最好连续装完凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床至少长30cm，使胶床表面保持2-3cm液层。
注意：整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新装住。
（3）平衡：继续用磷酸缓冲液洗脱，调整缓冲液流速，平衡20-30分钟。
（4）样品制备：
①取1ml鸡的抗凝血放入小烧杯中，加5ml pH7.0 的磷酸缓冲液，再加入27.5mg K3Fe(CN)6固体，用玻棒搅动使其溶解，即得褐色的高铁血红蛋白溶液。
②吸取 1ml FeSO4溶液和 1ml EDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小烧杯中混匀。（注意：还原剂混合液要新鲜配制，尽可能缩短其与空气接触的时间）。
（5）上样：旋开层析柱上端旋扭，待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶（即缓冲液液面与胶床平面相切）时，立即加入0.4ml上述混合液，待其进入胶床表面仅留约1mm液层时，加入0.5ml缓冲液，再当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取0.5ml血红蛋白样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央，注意切勿冲动胶床。慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm 液层时，用乳头滴管加入少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后用液管小心加入3～5cm 高的洗脱缓冲液。
6．洗脱：继续用磷酸缓冲液洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6滴。
7．凝胶的回收：实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。
2、实验结果与分析
从实验过程可以清楚滴看见凝胶过滤的分离效果。当装柱完成后，首先加入的是磷酸缓冲液，洗脱一定时间后，再加入FeSO4溶液和EDTA-Na2-NaHPO4溶液的混合液;此时凝胶柱内会有一段黄色带，当此黄色带再磷酸缓冲液的洗脱下完全进入凝胶柱内后，再加入的是血红蛋白样液，这时可以看见之前的黄色带上面是紧跟着的是红色条带;再当此红色条带完全进入凝胶柱内后，继续用磷酸缓冲液洗脱，可以看见，红色条带会慢慢下移，然后与黄色条带重合，之后再超过黄色条带，以较快速度继续向下移动，整个过程可以清楚的看见红黄两个明显的条带。最后，红色条带会先于黄色条带被洗脱出来。将洗脱出来的红色洗脱液与之前配制的高铁血红蛋白（稀释10倍）分别进行扫描，得到的曲线如下：
①此为红色洗脱液扫描所得曲线
②此为高铁血红蛋白稀释10倍后扫描所得曲线
3、讨论
现将具体分析实验现象。本实验利用凝胶过滤的特点，当加入FeSO4溶液和EDTA-Na2-NaHPO4溶液的混合液时，首先形成的是一个还原带，加入血红蛋白样液（此样液即是血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）后，由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫色的亚铁血红蛋白，亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液中溶解的氧结合，形成鲜红的氧合血红蛋白，而铁氰化钾分子量小，呈黄色带远远地落在了后面。试验过程中红色带在穿越黄色带的前后颜色变化并不明显，但还是可以明显的将黄色带与红色带区分开来。
TSK-GEL柱(亲合凝胶过滤)
TSK-GEL柱（亲合/凝胶过滤） （东洋曹达） TSK－GEL HPLC柱广泛用于生物高分子（特别是肽和蛋白质）的分析、提纯和离析。 亲合柱 高效、树脂基TSK－GEL亲合柱（10μm颗粒），用于分离或提纯多种酶和其它蛋白质。 表1叙述了所提供柱的特性。 表1：TSK－GEL亲合柱特性 凝胶过滤 TSK－GEL SW和SW XL柱含硅胶基亲水键合相填料与蛋白质相互作用最小。普及型TSK－GEL SW和SW XL柱的性质列于表2。 表2：TSK－GEL SW和SWXL柱的特性 （流动相：在0.1M磷酸盐缓冲剂（PH0.7）中0.03M Nacl水溶液。） 一根30 cm TSK-GEL SW XL柱和一根60cm TSK-GEL SW柱提供类似的分辨，但是SW XL柱只需一半时间。样的容量随柱 长按比例增加。 图A，在TSK－GEL和TSK－GEL SW XL柱 上具有相当的分辨。因为TSK－GEL SW XL柱 和TSK－GEL SW柱是硅胶基质，绝不能超 出推荐的PH：2.5-7.5范围之外的操作。详细 操作条件随柱资料中说明。我们建议用适当的
SW XL柱和SW保护柱保护这些柱子。 TSK－GEL QC－PAK柱尤其在质量控制应用中提供快速、高分辨分析。15cm玻璃或不锈钢柱用5μm SW XL载体填充。TSK－GEL PW和TSK－GEL PW XL柱用于工业水溶性聚合物和低聚糖的高性能凝胶过滤分离。这些柱的特性列于表3（略）。 亲水聚合物基质具有极好的化学和机械稳定性。虽然，通常使用含水溶剂，但该聚合物可与多达50％有机溶剂相溶。亲水PW型树脂的亲水性不如多糖凝胶，因此，加入有机改性剂或有时需要减少盐浓度以降低疏水相互作用。除G-Oligo-PW和G2000PW之外，TSK型树脂具有少量剩余负电荷。 TSKgel GMPW和TSKgel GMPW XL柱是在宽分子量范围内呈线性校正曲线的混合床柱。因为混合床柱的孔尺寸与窄孔尺寸柱相同，校正曲线的斜率要陡的多，这样就限制了分辨。当样品的分子量组成未知时，混合床柱对于其初步研究是理想的。当样品的分子量分布非常宽时，将选择具有某一孔尺寸（或孔尺寸范围）的第二根柱（或一系列柱）串接，以提供最佳分辨。TSKgel G-Oligo-PW柱专门用于分离不带电的或阳离子低聚物。少量残存正电荷使得G-Oligo-PW和G2000PW柱不适于分析阴离子低聚物。 另一种专用柱TSKgel G-DNA-PW柱与G6000PW柱的区别在于其颗粒尺寸更小，具有更高柱效，适于核酸分离。对于G2500PW到G6000PW和GMPW柱建议使用一根TSKgel PWH保护柱。对于所有PW XL柱和G-NDA-PW柱应使用TSK gel PW XL保护柱，使用Oligo保护柱保护G-Oligo-PW和G2000PW柱。可定购散装填料重新填充PW－型柱和保护柱。 疏水作用 疏水作用色谱法（HIC）和反相液相色谱法（RPLC）都是基于蛋白质的疏水性进行分离，并允许蛋白质选择性结合和吸附。但是HIC在相当低的结合能下分离并使用含水流动相。这些特性提供了不大可能干扰蛋白质构象的柔和分离方法。因此，HIC通常更好的保持物质活性。TSK -GEL Ether（醚）-5PW，phenyl（苯基）-5PW和Butyl（丁基）-NPR树脂基柱为色谱条件优化提供了一个疏水性范围。通过使用完全疏水的填料（如丁基）可使硫酸铵浓度降至最低。纯化完全疏水的蛋白质建议使用Ether-5PW柱。Ether-5PW和phenyl-5PW填料基质为TSKgel G5000PW树脂，因此，10μm颗粒具有的孔径为1000?。Butyl-NPR填料是由2.5μm无孔颗粒制备，允许快速分析。这三种柱型都可用0.2M NaOH清洗。通过使用相应的Toyopearl散装树脂可以实现放大（参见低压部分疏水作用） 羟基磷灰石 TSKgel HA－1000羟基磷灰石柱（粒径5μm）分离蛋白质或核酸（如来自单链DNA的双链DNA）。这些柱力学性能稳定并提供高度可重复分离。蛋白质回收率典型值为90％或更高，这部分归因于其大的孔体积（1000?）。 样品通过离子相互作用吸附和蛋白质或核酸同羟基磷灰石结晶结构的空间匹配而得到分离。向流动相中加入0.1mM Cacl2将最大限度延长柱寿命，而不影响蛋白质或核酸的分离。通常，用于蛋白质分离的柱也可用于核酸分离。来自蛋白质样品的少量脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶污菌会使核酸降解。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操 作 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。 ②凝胶介质的处理和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约 1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。 ③上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经μm孔径滤膜过滤或10， 000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为 mol/L；Sephacryl凝胶应为 mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达 mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在 1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。 ⑤分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。
蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法
蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析法 一、目的： （1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 （2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 二、原理： 凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即： Vt=Vo+Vi+Vg Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体 积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。 它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成： 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的
实验报告血红蛋白doc
实验报告血红蛋白 篇一：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤 实验报告 课程名称：生化实验B实验日期： 班级：姓名学号： 血红蛋白凝胶过滤 一、背景及目的 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。 凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的
分离效果。 影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。 影响凝胶过滤的因素主要有： 1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。 2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。 3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。 4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。 目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点： 1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性 二、实验原理 层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)
001凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存
凝胶过滤层析实验中Sephadex 的溶胀与回收保存 王 璞,林 红,朱 滨 (北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系,北京 100083) 摘 要:Sephadex (交联葡聚糖凝胶)是多糖类物质,尽管其结构、性能较稳定,但在压力、强酸、氧化 剂存在情况下,也会发生部分糖苷键水解,或凝胶交联结构受损。在使用过程中,或使用后处理、保存过程中,可能会因上述原因或情况发生而影响凝胶层析的分离效果。该文根据作者自己的工作经验,着重介绍了回收后的交联葡聚糖的干燥保存法,以提高交联葡聚糖的稳定性和重复使用率。关键词:交联葡聚糖凝胶;溶胀;脱水;干燥中图分类号:Q5233 文献标识码:B 文章编号:100224956(2006)022******* Methods About S welling,Recovery and Preservati on of Sephadex in Gel Filtrati on Chr o mat ography WANG Pu,L I N Hong,ZHU B in (Depart m ent of B i oche m istry and Molecular B i ol ogy,School of BasicM edical Sciences,Peking Uni 2 versity,Beijing 10083,China ) Abstract:Sephadex is a gr oup of highly s pecialized gelfiltrati on and chr omat ographic media which composed of mac 2r oscop ic beads synthetically derived fr om the polysaccharide,dextran .A lthough their structures and characters are relatively stable,the hydr olysis of glucosidic bond or structures failure of gel cr oss 2linkage will happen when Sepha 2dex is exposed in great p ressure,str ong acid and oxidants in the p r ocess of use,recovery and p reservati on .The effects of gel filtrati on will be decreased just on these conditi ons .I n this paper,the authors intr oduced a kind of avail 2able Sephadex recovery and p reservati on method 22dehydrating/drying method that could greatly i m p r ove the stability and repeat utilizati on of Sephadex . Key words:Sephadex;s welling;dehydrati on;drying 收稿日期:2005206202 作者简介:王 璞(1976—),北京市人,大专,实验技师1 凝胶过滤层析因其操作简便、操作条件温和, 不易引起生物样品变性失活,分离效果好而广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离纯化。具有分子筛效应的多孔性网状凝胶都可用作凝胶过滤层析的支持物。我们在本科生生化实验中选用了人工合成的SephadexG 250(交联葡聚糖凝胶)作为层析支持物来分离血红蛋白与DNP 2鱼精蛋白的混合物。交联葡聚糖是由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的多孔网状凝胶,成品为细小的白色颗粒状粉末,由于含有大量羟基,使其具有很强的亲水性,能迅速在水或电解质溶液中溶胀,因此使用非常方便。但由于操作过程溶胀处理,层析时有一定压力洗脱,或偶有pH 变化,或接触氧化剂,使2OH 发生氧化,都会影响凝胶的结构、性能。针对 上述可能影响凝胶分离效果的几个环节,我们在实 际工作中,对凝胶的溶胀、回收和保存几个环节进行了部分改进,尤其是回收后的干燥保存法经济实用、应用效果好。 1 Sephadex G 250的溶胀 Sephadex 能耐受0.2mol/LNa OH 长时间处理和pH 中性下高压蒸煮。Sephadex 为干粉状,使用前 必须使其在水中充分溶胀,溶胀是否彻底会直接影 响蛋白质分离效果。 (1)室温溶胀法 取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,用玻璃搅棒轻轻搅匀,用封口膜密封,室温放置过夜,使其充分溶胀,第2天进行倾斜浮选,除去漂浮于水面的细小颗粒,备用。处理过程中应避免剧烈搅拌,以防止破坏凝胶结构。此法较温和,不易造成凝胶结构的改变,推荐使用。 (2)加热溶胀法 取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,于沸水浴 中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊) 实 验 技 术 与 管 理EXPER I M ENT AL TECHNOLOGY AND MANAGE MENT Vol .23 No .2 FEB. 2006
凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography
凝胶过滤层析gel filtration chromatogra phy 定义 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛chromatography）、分子筛层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography）Chromatography） 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。进行脱盐、去热源和脱色。 原理 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。小分子进入当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子当样品溶液通过凝胶柱时，相对分
子葡聚糖珠内质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进相对分子质量较小的物质可自由地进大分子不出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移能进入珠内，经珠动速率慢而最后流出层析柱。之间缝隙中等大小的分子在大分子物质与小分中等大小的分子在大分子物质与小分流出子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 带网孔的葡聚糖珠 固定相（凝胶）固定相（凝胶） 三维空间网状结构 小分子 样品流动相大分子 分子筛效应：分子筛效应：按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。胶柱中的迁移速度不同得到分离。 小分子被延滯 固定相 较快流出 基本概念 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积间液体流动相的体积。间液体流动相的体积。内
分子生物学第二章习题
第2章蛋白质结构 一、名词解释 1．两性离子（dipolarion） 2．必需氨基酸（essential amino acid） 3．等电点(isoelectric point,pI) 4．稀有氨基酸(rare amino acid) 5．非蛋白质氨基酸(nonprotein amino acid) 6．构型(configuration) 7．蛋白质的一级结构(protein primary structure) 8．构象(conformation) 9．蛋白质的二级结构(protein secondary structure) 10．结构域(domain) 11．蛋白质的三级结构(protein tertiary structure) 12．氢键(hydrogen bond) 13．蛋白质的四级结构(protein quaternary structure) 14．离子键(ionic bond) 15．超二级结构(super-secondary structure) 16．疏水键(hydrophobic bond) 17．范德华力( van der Waals force) 18．盐析(salting out) 19．盐溶(salting in) 20．蛋白质的变性(denaturation) 21．蛋白质的复性(renaturation) 22．蛋白质的沉淀作用(precipitation) 23．凝胶电泳（gel electrophoresis） 24．层析（chromatography） 25．标准折叠单位 26．模体 二、填空 1．蛋白质多肽链中的肽键是通过一个氨基酸的_____基和另一氨基酸的_____基连接而形成的。 2．大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为___%，如测得1克样品含氮量为10mg,则蛋白质含量为____%。3．在20种氨基酸中，酸性氨基酸有_________和________2种，具有羟基的氨基酸是________和_________，能形成二硫键的氨基酸是__________. 4．蛋白质中的_________、___________和__________3种氨基酸具有紫外吸收特性，因而使蛋白质在280nm
生化习题 汇总
第一章 一、单选题 1、现有一混合的蛋白质溶液，各种蛋白质的pI分别为4.,5，5.0,5.2,6.5,7.4。预使该混合蛋 白质电泳时有3种蛋白质向正极移动，缓冲液的pH应该是（） A、4.0 B、5.0 C、6.0 D、7.0 E、8.0 2、下列测定蛋白质含量的方法中哪一种方法需要完整的肽键？（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 3、具有四级结构蛋白质的特征是（） A、分子中必须含有辅基； B、含有两条或两条以上的肽链； C、每条多肽链都有独立的生物学功能； D、依赖肽键维系蛋白质分子的稳定； E、以上都不对。 4、下列哪一种关于蛋白质结构的说法描述是错误的（） A、都有一级结构 B、都有二级结构 C、都有三级结构 D、都有四级结构 E、二级及三级以上的结构称为空间结构 5、下列关于蛋白质变性的描述中错误的是（） A、分子量变小 B、氢键断裂 C、亚基解聚 D、生物学活性丧失 E、疏水作用的破坏 6、蛋白质的氧结合曲线是（） A、双曲线 B、抛物线 C、S型曲线 D、直线 E、不能确定 7、丝心蛋白的主要构象形式是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、β-转角 D、无规卷曲 E、以上都有 8、维持蛋白质二级结构的主要化学键是（） A、疏水相互作用 B、氢键 C、盐键 D、二硫键 E、范德华力 9、依据蛋白质元素组成的特点测定蛋白质含量的方法是（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 10、下列哪一种氨基酸属于酸性氨基酸（） A、赖氨酸 B、甘氨酸 C、半胱氨酸 D、丝氨酸 E、天冬氨酸 11、下列不属于二级结构主要形式的是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、结构域 D、无规卷曲 E、β-转角 12、在一个肽平面中含有的原子数为（） A、3 B、4 C、5 D、6 E、7 13、从根本上来说镰刀型细胞贫血症是蛋白质（）改变的结果。 A、一级结构； B、二级结构； C、三级结构； D、四级结构； E、以上都不对。 14、下列关于蛋白质结构叙述中,不正确的是（） A、α-螺旋是二级结构的一种； B、.无规卷曲是在一级结构基础上形成的； C、只有二、三级结构才能决定四级结构； D、一级结构决定二、三级结构； E、三级结构即具有空间构象。 15、利用不同蛋白质所带电荷不同来分离混合蛋白质的层析技术是（） A、吸附层析； B、离子交换层析； C.凝胶过滤层析； D、亲和层析； E、分配层析。 16、关于蛋白质变构效应的描述,下列哪一项是错误的?（） A、氧对血红蛋白的作用属于正协同效应； B、氧对血红蛋白的作用属于负协同效应； C、氧与血红蛋白结合呈S型曲线； D、蛋白质变构是生物体内重要的代谢调节方式之一； E、氧是血红蛋白的变构剂。
生化实验报告 实验5 血红蛋白凝胶过滤
实验报告 课程名称：生化实验B 实验日期： 班级：姓名学号： 血红蛋白凝胶过滤 一、背景及目的 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。 血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。 凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。1凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是Kav 值的差异性，Kav 值差异性大，分离效果好；Kav 值差异性小，则分离效 果很差，或根本不能分开。 影响凝胶过滤的因素主要有： 1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。 2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。 3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。 4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。 目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点： 1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复 性 二、实验原理 层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。2 凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。 本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形 1百度百科凝胶过滤层析https://www.360docs.net/doc/b010621693.html,/view/81744.htm 2百度百科层析https://www.360docs.net/doc/b010621693.html,/view/15375.htm#2
生化选择题汇总
第一章1、现有一混合的蛋白质溶液，各种蛋白质的pI分别为4.,5，5.0,5.2,6.5,7.4。预使该混合蛋白质电泳时有3种蛋白质向正极移动，缓冲液的pH应该是（） A、4.0 B、5.0 C、6.0 D、7.0 E、8.0 2、下列测定蛋白质含量的方法中哪一种方法需要完整的肽键？（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 3、具有四级结构蛋白质的特征是（） A、分子中必须含有辅基； B、含有两条或两条以上的肽链； C、每条多肽链都有独立的生物学功能； D、依赖肽键维系蛋白质分子的稳定； E、以上都不对。 4、下列哪一种关于蛋白质结构的说法描述是错误的（） A、都有一级结构 B、都有二级结构 C、都有三级结构 D、都有四级结构 E、二级及三级以上的结构称为空间结构 5、下列关于蛋白质变性的描述中错误的是（） A、分子量变小 B、氢键断裂 C、亚基解聚 D、生物学活性丧失 E、疏水作用的破坏 6、蛋白质的氧结合曲线是（） A、双曲线 B、抛物线 C、S型曲线 D、直线 E、不能确定 7、丝心蛋白的主要构象形式是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、β-转角 D、无规卷曲 E、以上都有 8、维持蛋白质二级结构的主要化学键是（） A、疏水相互作用 B、氢键 C、盐键 D、二硫键 E、范德华力 9、依据蛋白质元素组成的特点测定蛋白质含量的方法是（） A、凯氏定氮法 B、紫外吸收法 C、茚三酮反应 D、双缩脲法 E、考马斯亮蓝法 10、下列哪一种氨基酸属于酸性氨基酸（） A、赖氨酸 B、甘氨酸 C、半胱氨酸 D、丝氨酸 E、天冬氨酸 11、下列不属于二级结构主要形式的是（） A、α-螺旋 B、β-折叠 C、结构域 D、无规卷曲 E、β-转角 12、在一个肽平面中含有的原子数为（） A、3 B、4 C、5 D、6 E、7 13、从根本上来说镰刀型细胞贫血症是蛋白质（）改变的结果。 A、一级结构； B、二级结构； C、三级结构； D、四级结构； E、以上都不对。 14、下列关于蛋白质结构叙述中,不正确的是（） A、α-螺旋是二级结构的一种； B、.无规卷曲是在一级结构基础上形成的； C、只有二、三级结构才能决定四级结构； D、一级结构决定二、三级结构； E、三级结构即具有空间构象。 15、利用不同蛋白质所带电荷不同来分离混合蛋白质的层析技术是（） A、吸附层析； B、离子交换层析； C.凝胶过滤层析； D、亲和层析； E、分配层析。 16、关于蛋白质变构效应的描述,下列哪一项是错误的?（） A、氧对血红蛋白的作用属于正协同效应； B、氧对血红蛋白的作用属于负协同效应； C、氧与血红蛋白结合呈S型曲线； D、蛋白质变构是生物体内重要的代谢调节方式之一； E、氧是血红蛋白的变构剂。 17、关于β-折叠的叙述哪项是正确的？（） A、β-角蛋白具有典型的β-折叠结构； B、两个相邻的肽键平面呈摺扇式折叠； C、β-折叠是一种较伸展的肽链结构； D、肽链间肽键平面上的N-H与C=O形成氢键；
糖的滤纸层析实验报告doc
糖的滤纸层析实验报告 篇一：纸层析法分离氨基酸实验报告 前言 纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中
滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC 应用普遍。在 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 图1 叶绿素的分离 氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占
凝胶过滤注意事项
凝胶过滤(gel filtration,GF)注意事项 1.层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。 2.凝胶柱的鉴定 凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。 3.洗脱液的选择 由于凝胶过滤的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶过滤中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶过滤洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶过滤的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。 4.加样量 关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1%－5%左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10%－25%。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过（Ve1－Ve2）。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则
生物学检测试题
生物检测试题 注意事项：1.所有试题使用2B 铅笔在机读卡上作答；2.试题按学科分类，单选和多选题混排) 一、细胞生物学、生物化学、微生物学、生物信息学、生物技术（31 题38 分） 1. 下列没有细胞壁的细胞是：（单选，1 分） A. 细菌 B. 酿酒酵母细胞 C. 蓝藻 D. 支原体 2. 蝌蚪尾巴消失的过程中，主要涉及：（单选，1 分） A．细胞衰老B．细胞分化 C. 细胞凋亡D．细胞增殖 3.Hox 基因（同源异型基因）与下列哪种功能直接相关：（单选，1 分） A. 表观遗传 B. 细胞周期调控 C. 细胞凋亡 D. 细胞分化与发育 4.经常接触粉尘的人容易患肺部疾病，如矽粉引起的矽肺，下列哪种细胞器和矽肺的形成直接相关：（单选，1 分） A. 内质网 B. 线粒体 C. 高尔基体 D. 溶酶体 5. 下列有关核糖体的陈述，正确的是：（单选，1 分） A. 真核细胞核糖体大亚基的rRNA 包括5 S、5.8 S、28 S 三种 B. 在体外实验中，随着溶液中Mg2+浓度升高，完整的核糖体易解聚为大小亚基 C. 在体外实验中，随着溶液中Mg2+浓度降低，核糖体易形成二聚体 D. 核糖体中发挥主要催化作用的成分是某些核糖体蛋白 6. 内质网是细胞中“钙库”之一，以下描述正确的是：（单选，1 分） A. 钙离子从细胞质扩散到内质网 B. 内质网上的钙泵将钙离子从细胞质主动运输到内质网 C. 钙离子通过内质网上的钙离子通道主动运输到内质网 D. 钙离子通过钠钾泵协同转运到内质网 7. 动物细胞培养工作始于20 世纪初，其后得到广泛的发展。Hayflick 和Moorhead 的实验发现在体外培养的细胞经过40-60次群体倍增后便不再分裂了。这一发现源于下列何种生理现象？（单选，1 分） A. 细胞衰老 B. 细胞凋亡 C. 细胞自噬 D. 细胞坏死 8. 在有丝分裂纺锤体组装过程中，负责对微管进行捕获的结构是：（单选，1 分） A. 染色体动粒 B. 染色体臂 C. 中心体 D. 姊妹染色单体间的黏连蛋白 9. 在真核细胞中, 三羧酸循环发生在：: （单选，1 分） A. 线粒体外膜 B. 线粒体内膜 C. 线粒体基质 D. 内质网 E. 高尔基体 10. 下列核酸合成过程中，哪项是无需模板的？（单选，1 分） A. 转录 B. 逆转录 C. PCR D. 合成真核细胞中mRNA 的3，polyA 11. 存在于RNA 双螺旋但不存在于DNA 双螺旋的碱基对是：（单选，1 分） A. GC B. GU C.AT D. AC 12. 下列关于α-螺旋的叙述，正确的是：（单选，1 分） A. α-螺旋每圈螺旋占3 个氨基酸残基 B. α-螺旋通过疏水相互作用使结构稳定 C. 左手α-螺旋构象比较稳定 D. 多肽链中含有脯氨酸时影响α-螺旋的形成 13. 在大肠杆菌中，切口平移（nick translation）是的过程。（单选，1 分） A. 除去冈崎片段 B. 由DNA 聚合酶II 除去RNA 引物 C. 形成引发体并合成RNA 引物 D. 除去RNA 引物同时填补DNA 链空缺（gap） 14. 如果一种mRNA 的序列是5′UCAGACUUC 3′，那么它的DNA 编码链序列是：（单选，1 分） A. GTTGTCTGA B. AGTCTGAAG C. TCAGACTTC D. GACGGCTGA 15. 镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病。当此病发生时，会发生下列哪种变化？（单选，1 分） A. 电泳时血红蛋白向正极的迁移率增加 B. 去氧血红蛋白聚集 C. 血红蛋白溶解度增加 D. 血红蛋白分子量增加 16. 在原核生物的蛋白质合成过程中，催化形成肽键的是：（单选，1 分） A. 氨酰tRNA 合成酶 B. 移位酶（EF-G） C. 23S rRNA D. 核糖体小亚基 17. 辅因子对于酶的活性是非常重要的。通常作为羧化酶的辅因子；而则作为脱羧酶的辅因子。（单选，1 分） A. 烟酰胺；四氢叶酸 B. 生物素；焦磷酸硫胺素（TPP） C. 磷酸吡多醛（PLP）；泛酸 D. 硫辛酸；钴胺素（维生素B12）
凝胶过滤层析分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 K av是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的K av=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的K av=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤K av﹤1，在中间位置被洗脱。可见，K av 的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因K av值不同而被分离。 三、仪器与试剂 1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 （1）标准蛋白 a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液