二。血液肿瘤的分子检测---汝昆

分子生物学异常
正常核型伴： NMP1突变 或CEBPA突变而且无 FLT3-IDT t(8;21), t(15;17),inv(16) or t(16;16): 伴c-KIT突变
预后中等
预后不良
正常核型： 伴FLT3-ITD 突变 伴c-kit突变
基因突变分布以及检测层面的意义
髓系 白血病
淋系 白血病
诊断学
病理
临床实验室
检验
外科病理
临床化学 特殊检查 流式细胞学， 遗传学，分子 生物学 血液学 微生物学 免疫学
细胞学 法医学
血液肿瘤的综合诊断
M G I M
形态学 免疫分型
遗传学 分子生物学
特殊检查
蛋白水平:
• 深度测序 –突变MRD的监测 • 检测速度快
血液病的“基因扫描” -外显子捕获测序
TET2 SRSF2 NRAS FLT3 TP53
SF3B1
CBL EZH2
IDH1 KRAS ASXL1 PTEN
MPL IDH2 KIT
AML
DNMT3A
RUNX1 WT1
NPM1 CEBPA
PTPN11 JAK1
C/A/G/T
一级分析 二级分析 高级分析 系统控制软件 CASAVA等 GenomeStudio等 碱基判读 序列分析 生物学意义挖掘及展示
BRAF
造血过程相关 组蛋白修饰相关 新基因
FAT1
FAT3
MLL2
BMI1
DNMT3A
NOTCH1
PHF6
WT1
Nature 481：157-163. 2012
范可尼贫血（Fanconi Anemia，FA）
定义
范可尼贫血（Fanconi anemia，FA）是一种 常染色体隐性遗传病，为先天性再障中最为常 见的一种
– – – – 免疫组化 流式细胞学 免疫荧光/电镜 蛋白质组学
分子水平:
– 染色体水平 – 核酸水平 – 基因组学、表观遗传学
遗传变异的类型
每条染色体的 " 两个拷贝
* * * *
1" 2"
A" G"
序列多态性
1" 2"
长度多态性
单核苷酸多态性 (SNP)
串联重复
串联重复的两种类型
SAMHD1
TP53 KIT IDH1 CBL TET2 PHF6 SF3B1
SETBP1
NPM1 FLT3 NRAS JAK2
FBXW7
DNMT3A
IDH2
ASXL1 SRSF2 SUZ12 I KZF1 JAK1
NOTCH1
MDS
WT1 SF1 ZRSR2
U2AF1
RUNX1
MPN
SH2B3 NF1 KRAS MPL
FANCA
最常见的三种FA 相关基因：FANCA、FANCC 和FANCG，这三种基因突变约占全部FA 患者 的85%
分子检测
FANCC 涉及范围
分析FANCA，FANCC，FANCG外显子范围 内的点突变、短片段的插入和缺失型突变
FANCG
突变基因在血液疾病中的分布 CML ALL MM
MDS FA MPN
JAK2
SH2B3
PHF6
NOTCH1
TP53 PHF6 RUNX1 PTEN
FBXW7
FLT3 ASXL1 DNMT3A JAK3
TEL/ETV6
JAK1
B-ALL T-ALL
RAS FLT3
EZH2
NF1
WT1 PTPN11 IKZF1
JAK2
CRLF2
PAX5
HLH
Lymphoma
AML CLL
TTP
高通量测序进行“基因扫描”
我们通过外显子捕获测序 对血液疾病进行“基因扫 描”。 检测在血液疾病发生、发 展过程中起关键及辅助作 用的基因进行全外显子的 一个捕获和深度测序，发 现这些 “元凶”及“从 犯”的一个本质的特征 （点突变、短的插入和缺 失，以及重复序列），从 而轻松的协助疾病的诊断， 并对疾病进行一个危险度 的分层、预后判断以及用 药的指导等。
ABL1
SETBP1
IDH2 IKZF1 NRAS PHF6 KRAS CALR RUNX1 IDH1 TET2 CSF3R CBL EZH2
CML
BRAF NF1
PTPN11
CLL
SF3B1 TP53 NOTCH1
XPO1
ZMYM3
CLL
MYD88
DDX3X
FBXW7 MAPK1 BIRC3
ATM
大插入/缺失, 扩增, 易位 (5 Mb) 一名习惯性流产妇女发生 t(6;15) 染色体变异
原位杂交（选择）: "
大插入/缺失,扩增, 易位 乳腺癌细胞扩增Her2基因
分子诊断：检测DNA改变的策略
基于PCR的方法: "
PCR，Q-PCR， HRM!
基因测序的方法: "
Sanger’s!
four-dye system
诊断： – 鉴别诊断 – 预后判断
不同的肿瘤形态相似 同一肿瘤形态不同
M0
诊断： – 鉴别诊断 – 预后判断
不同的肿瘤形态相似 同一肿瘤形态不同
同一肿瘤遗传背景不同 （肿瘤的异质性）
弥漫性大B细胞淋巴瘤 -­‐Unsupervised analysis
无法治愈率：60% 57个基因分为3组: 生发中心B细胞样DLBCL q t(14;18)异位（bcl-2） q 染色体2p上的c-ref扩增 活化的B细胞样DLBCL
测序 图像 强度 碱基判读 读序 比对、拼接 变异 生物学意义
single-dye system
Chromato
gram file
分子诊断：新的检测DNA改变的策略
微阵列
不能发现未知基因
二代测序: "
不适合发现大的插入/缺失, 扩增, 易位 "
DNA microarrays
Ordered arrangement of multiple sets of DNA on solid support
分子生物学在血液肿瘤 诊断中的应用
中国医学科学院 血液病医院 汝 昆
分子诊断
Genomics Transcriptomics Proteomics
Diagnostic Technologies Molecular Pathology
Targeted Therapies
病理学通过分析人体组织和体 液的异常来作出诊断
FGFR3 MAFB MUM1/IRF4 PAX5 PRDM1 RB1 TRAF3 。。。
T-ALL
NRAS GATA3 EZH2 DNM2
KRAS ETV6 EED ECT2L
FLT3 RUNX1 SUZ12 RELN
IL7R IKZF1 SETD2
JAK3 EP300 EP300
JAK1
SH2B3
小卫星 或 数目可变串联重复序列 ! (VNTR)! 微卫星 或 短串联重复序列 (STR)!
8 – 80 bp Repeats
2 – 7 bp Repeats
DNA 水平上的改变 – 小的改变 !
点突变
CCTGAGGAG"
CCTGTGGAG"
例如: 血红蛋白, β –镰刀形红细胞贫血病
缺失/插入
GAATTAAGAGAAGCA" 例如: 表皮生长因子受体 – 肺癌
GAAGCA!
重复改变!
TTCCAG…(CAG)5…CAGCAA" TTCCAG…(CAG)60…CAGCAA" 例如:亨廷顿蛋白 –亨廷顿病
不同个体的基因组中大 概0.4%的基因是CNV。 Hg: alpha Amylase：6-15 copies Alu序列 Fragile X syndrome
测序流程
01
02
03
04
构建文库
制备模板
运行序列
分析数据
3.5小时
3小时
2小时
0.5小时
683
患者中发现的SNP和in/del
COSMIC，dbSNP, 1000 genome数据库查询
正常多态性
罕见突变
基因突变
临床致病性
以往研究中有过报道
没有报道
临床可能致病性
新发现的可能致病性
影响结果可靠性因素
DNA水平上的改变 – 大的改变!
缺失/插入 " 22q11.2 region –" " DiGeorge 综合征
扩增
" 17q21.1 (Her2) –" " 乳腺癌
易位
Der 22" 22" 9" Der 9"
t(9;22)(q34;q11) –" CML
传统的检测DNA改变的策略
细胞遗传学（筛选）: "
q
n
n
NF-κB的活化
n
3 பைடு நூலகம்DLBCL
NEJM 2002. 346:1937-47 Blood 2002. 99: 2285-90 J Exp Med 2001. 194: 1861-74
AML中影响治疗和预后的突变
风险级别 预后良好 遗传学异常
t(8;21) t(15;17) inv(16) or t(16;16) 正常核型 +8 t(9:11) 其他未定义型 复杂核型 -5, 5q-, -7, 7q11q23: 不包括 t(9;11) inv(3), t(3;3) t(6;9) t(9;22)
PAX5 EZH2 CALR
ARIDA ATM BCL2 BCL6 BIRC3 CCND1 CDKN1A CREBBP CRLF2 CXCR4
淋巴瘤
EPHA7 FAT1 MLL2 NOTCH2 PDGFRB PIK3CA TAL1 TEL WHSC1 。。。
骨髓瘤
CCND1 CCND3 c-MAF c-MYC CYLD DIS3 FAM46C 。。。
单基因单位点检测
单基因所有位点检测
MDS
MPN
所有疾病相关基因 的所有位点检测
基因检测，目前临床主要采用 Sanger测序和/或者PCR检测方法
局限性： 1. 2. 3. 4.
费用高 通量低 费人力 周期长
高通量基因测序时代到来-多基因检测
• 降低检测成本 • 通量大，灵活
– 同时检测多种基因 – 基因的全部外显子检测