细胞凋亡、细胞周期

Caspase-3 data（FCM）
Jurkat T-Cells
Mouse Thymocytes
Caspase-3 Kits
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit
PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit
注意事项：
1. 细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性 2. 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子
BD Annexin V 流式检测试剂盒
Kit
Cat no.
Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I 556547
Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains unlabeled recomb. Annexin V
Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I
556570 559763
提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500 等多种荧光标记的Annexin V以及纯净的Annexin V。
Annexin V检测常见问题
BD流式系列课堂-1：
研究细胞生命活动的流 式解决方案
细胞凋亡概述
• 又称为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death) 是机体主动的、高 度有序地清除无用细胞的过程。和细胞坏死 (Necrosis) 相区别，坏死 是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程 。 薄膜有小泡状形成
小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段 。
• 检测方法 — Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋
亡百分比 — 末端转移酶标记技术
细胞核DNA检测原理：APO-BrdU
TdT: 脱氧核糖核苷酸末端转移酶
Brd UTP的渗入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高
TUNEL法: 流式分析晚期凋亡
JC-1 (Fl-2)
Jurkat T Cells
Control
R1
Mouse Thymocytes
Control
R1
R1
R2
Staurosporine
R1
R2
Camptothecin
R1
R2
Fas mAb
R1
R2
R2
R2
JC-1 (Fl-1)
3. 凋亡相关酶的检测- Caspase
• 背景知识
– 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通 常被降解，调节这一过程的蛋白叫做 Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）
• 只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做
2. 线粒体水平的检测
激活Caspase 9—激活Caspase 3—启动细胞凋亡
2. 线粒体水平的检测
• 凋亡与线粒体膜电位的去极化相关 • BD Mitoscreen (JC-1) Cat# 551302 25 tests • JC-1: 可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素 • 原理：
APO-DIRECT™ KIT 50 tests cat. 556381
1. 是否 Annexin V Kits 可以检测小鼠或其他物种?
• Annexin V试剂盒可以检测多种属
2. 这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细 胞、或组织?
• No. 上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的 样本建议用免疫荧光技术 (Cat. No. 550911)
3. 是否与细胞表面标记兼容? CD11B/MAC-1 LY-71
Cat No.
550480 550914
PARP cleaved –Caspase 3水解产物
• PARPs：一类由DNA链断裂而被激活 的DNA 修复酶。PARP可以被Caspase3水解成两个大小分别为24-和89-kDa 的片段而失活
• PARP cleaved是凋亡细胞中活化的 Caspase-3水解产物，代表Caspase酶 失去活性
JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（ FL-2 Channel）； 细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降 低，JC-1 以单体形式存在于胞浆内，荧光 强度减弱甚至消失 ，故用 荧光信号的变化判别凋亡的发生。
p 操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测
JC-1检测结果流式图
– Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞 的重要组分，即Caspase 3激活==细胞 凋亡
– 检测原理：是通过特异性抗体检测 全长或者剪切后的Caspase活性。
Caspase-3 data（IHC）
Jurkat T-Cells
6 µM camptothecin for 4 h untreated
早期凋亡PS检测及结果判定
Annexin V-FITC
PI
细胞膜变化的检测：Annexin V/PI
优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞
样本设置：
1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电 压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。 2. 阴性对照：未诱导的，Annexin V/PI双染，细胞绝大部分都 在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非 特异性结合。 3. 单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿 4. 单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿
• 细胞凋亡的标志
PARP cleaved –Caspase 3水解产物
Jurket细胞用不同浓度的喜树碱处理结果
Hela 细胞 A. 未处理组 B. 星孢菌素处理组裂解的PARP cleaved阳性
化疗前后胃癌活检标本中PARP Cleaved+细胞
4. 细胞核DNA检测
• 凋亡晚期 — DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核
细胞凋亡与疾病的关系
3
细胞凋亡事件发生表
细胞膜事件 线粒体事件 Caspase事件 细胞核事件
1. 细胞膜变化的检测：Annexin V/PI
磷脂酰丝氨酸 (PS) 的检测：早期凋亡
早期凋亡PS检测及结果判定
早期凋亡ຫໍສະໝຸດ Baidu征：
• 磷脂膜(PS)外翻，但是 细胞膜保持完整性， 因此PI染色为阴性
• DNA没有发生断裂