慢病毒实验方法

转染方法1-磷酸钙法转染HEK293T 细胞

磷酸钙法转染HEK293T 细胞

1. 试剂配制:

无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;

2XHBS: 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;

2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.

2. 实验过程:

1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105

个细胞/35mm dish.

2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:

ddw: 105ul

plasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)

2M CaCl2: 16.5ul

2XHBS: 125ul

按上述顺序,往eppendorf 管中依次加入上述四种试剂.

先将前三者混匀, 最后加2XHBS.

一种方法是,加2XHBS 时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h 后换液.

另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.

转染方法2-Fugene转染

病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养

箱10min

即可使用，铺细胞前，将明胶再次将瓶底完全覆盖一次，完全吸净，即可将细胞铺上。

传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL 10％DMEM培养基。

1.1传293T细胞

将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf管中，加入450ul 10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。

2．转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。

3．做脂转complex：Opti MEM需在37度水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。

转染每瓶T75的complex成分如下：

含cDNA的lv质粒：10ug

pVSVG：5ug

delta 8.91：7.5ug

opti MEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入56ul Fugene转染试剂，加至opti MEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，隔2-4h后再晃匀一次即可。

4．转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％DMEM 10mL，即开始收集病毒。5．收集24-48h病毒上清，收集后置于4度冰箱保存。

感染方法-病毒滴度测定(感染同此法)

5.1此时即可用病毒上清测病毒滴度（悬浮感染）：

①.在24孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被24孔板10min以上（同步骤1，每孔加入200ul 明胶，移液管两滴左右）。

②.消化293T细胞（步骤1.1），24孔板每孔15万细胞。可将细胞做mix，体积扩大到15万细胞/500ul，加入1/1000 polybrene，混匀，每孔加入500ul 15万细胞即可。

③.将病毒上清4000rpm离心5min，将细胞碎片离至管底。取5ul病毒上清至上述步骤中传入15万每孔的24孔板一孔中，摇匀；48h后即可在荧光显微镜下观察其滴度。

5.2病毒滴度确定：

①. 15万293T细胞48h即可刚好长至90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。

②. 将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于293T细胞易飘，固定及DAPI 染色整个过程请务必保持293T细胞处于液面之下。用PBS涮3次。加入4％ PFA室温固定30min, 24孔板每孔200ul。

③．用PBT洗2次，每次3分钟。

④．PBS将DAPI 1000倍稀释，每孔加入200ul，避光室温静置5min。

⑤．PBS洗2次，每次5分钟，即可在荧光显微镜下计数，取2-3处取平均值。

⑥．病毒滴度（IU/mL）=荧光细胞占总细胞数的百分比÷5×1.5×105×103

Protocol for Production of Lentiviral Vectors in 293T cells

Day 1 Plating (9-10am)

Plate 2-2.5x106 of 293T cells per 10cm plate

Day 2 Transfection (9-10am)

Prepare calcium-phosphate precipitate (1ml/10cm plate)

∙Transfer vector - 20µg

∙Packaging plasmid - 15µg (3rd generation: pMDL g/p RRE - 10µg + pRSV-Rev - 5µg) ∙Envelope plasmid - 6µg

Add water to 0.5ml, add 0.5ml 2xHBS and mix well. Add 50µl 2.5M CaCl2 and shake briefly, keep in RT for 20-25min, add dropwise on a plate and mix gently with a medium

Change medium (6-8hrs later); remove medium with precipitate and add 6ml/plate of fresh medium

Day 4 Collection (9-10am)

∙Collect medium

∙Spin 3000rpm/5min/RT

∙Filter through 0.45 µm

At this point virus can be used for transduction, frozen at -70°C for future use, or concentrated Concentration

Transfer 30ml of virus to 33ml Beckman conical tubes spin at 26.000rpm/2hrs/4°C in Beckman SW28 swingle bucket rotor. After spin discard supernatant and resuspend the virus in a desired volume of serum-free medium (e.g. Cellgro or Episerf) or PBS/1% BSA, aliquot and store at

-70°C. For transduction of very delicate cells the virus can be concentrated on sucrose cushion, just put 4ml of 20% sucrose on the bottom of the tube and overlay with 26ml of viral supernatant.

Reagents:

∙ 2 x HBS (for 500ml)