miRNA-21在结直肠癌中的表达研究

miRNA-21在结直肠癌中的表达研究

邱实;孟凡旭;刘念;刘林林

【摘要】目的检测MicroRNA-21(miRNA-21)在正常人和结直肠癌患者血清,以及结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达,探讨其与结直肠癌临床病理参数的关系.方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测正常人和结直肠癌患者血清,以及结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达,分析miRNA-21的表达与结直肠癌临床病理参数的关系.结果 miRNA-21在结直肠癌患者血清中表达水平显著高于正常人血清(P＜0.05);结直肠癌组织中miRNA-21表达水平明显高于癌旁组织;中晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)结直肠癌组织中miRNA-21表达水平明显高于早期(Ⅰ期和Ⅱ期)结直肠癌(P＜0.05);低分化肿瘤组织中miRNA-21表达水平明显高于中高分化者;有淋巴结转移的结直肠癌组织中miRNA-21表达水平明显高于无淋巴结转移者.结论miRNA-21在结直肠癌患者血清及肿瘤组织中呈高表达,可能与结直肠癌的发生发展有关.

【期刊名称】《中国实验诊断学》

【年(卷),期】2014(018)001

【总页数】3页(P91-93)

【关键词】微小RNAs;结直肠肿瘤;聚合酶链反应

【作者】邱实;孟凡旭;刘念;刘林林

【作者单位】吉林大学第二医院,放疗科,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,放疗科,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,放疗科,吉林,长春130041;吉林大学第二医院,放疗科,吉林,长春130041

【正文语种】中文

【中图分类】R735.3

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是胃肠道中常见的恶性肿瘤，随着近些年我国人口老龄化加剧、饮食习惯和生活方式的改变，结直肠癌的发病率和死亡率较前明显上升[1]。结直肠癌的早期筛查与诊断越来越受人们的关注。microRNA （miRNA）是由Lee等于1993年发现的一类新的长度为19－25的内源性非编码RNA分子，参与了发育、细胞增殖、分化及凋亡等一系列重要生命过程。近些年研究发现，在肿瘤发生发展过程中miRNA发挥类似抑癌基因和癌基因的作用，影响肿瘤的发生、发展[2]。本次研究应用实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测miRNA－21在正常人和结直肠癌患者血清，以及结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达，分析miRNA－21表达水平与结直肠癌临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2012年5月——2012年8月于吉大三院行手术治疗的42例经病理诊断为结直肠癌的患者为研究对象，术前未行放化疗。患者年龄52岁－74岁，中位年龄62岁，男26例，女16例，按照美国癌症联合委员会（AJCC）／国际抗癌联盟（UICC）结直肠癌TNM分期系统（2010年第七版）进行TNM分期。取肿瘤组织及癌旁组织（取材部位距离肿瘤边缘至少5cm的正常肠黏膜组织），离体10min内放入液氮保存；抽取患者术前及术后血液，保存于超低温冰箱。抽取同期16例健康人血液，年龄49岁－76岁，中位年龄61岁，其中男10例，女6例。

1.2 试剂及仪器

Trizol试剂（Takara公司）、DEPC 水（Takara公司）、miRNA isolation提取分离试剂盒（Takara公司）、MMLV Reverse Transcriptase（Takara公司）、Hairpin－itTM miRNAs RT－PCR Quantitation Kit试剂盒（苏州吉玛基因股份

有限公司）、引物hsmiRNA－21及内参U6均购自苏州吉玛基因股份有限公司；ABI－7300实时荧光定量仪（美国ABI公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取取3－5ml血液样本加入红细胞裂解液至10ml，3 000r／min离心10min，弃上清，沉淀中加入1ml Trizol，按照miRNA isolationg提取分离

试剂盒说明书中的步骤提取miRNA。

取液氮保存组织样本约500mg，研磨后加入1 ml Trizol，然后按照miRNA isolationg提取分离试剂盒说明书中的步骤提取miRNA。

使用紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度及纯度，其 A260／A280比值应在1.8－2.1之间，计算RNA浓度用于进一步实验。

1.3.2 RNA的逆转录取3μg模版RNA，加入4 μl 5×MMLV RT Buffer、0.75μl dNTP（10mM）、1.20μl MiR－RT primers（1μM）、0.25μl Rnasin（40U／

μl）及0.2μl MMLV Reverse Transcriptase（200U／μl），RNase－free water 将总体系补至20μl构成逆转录反应体系。使用普通PCR仪将提取的总RNA逆转录成cDNA。反应条件：25℃30min，42℃30min，85℃5min。

1.3.3 RT－qPCR 血清样本和组织样本逆转录得到的cDNA 为模版，按照 Hairpin －it TM miRNAs RT－PCR Quantitation Kit试剂盒说明书加入相关试剂及引物，以U6为内参，在ABI－7300实时荧光定量仪上进行PCR扩增。反应条件：

95℃3min预热，然后95℃12s、62℃40s共40个循环。

1.4 数据分析

本试验采用2－ΔΔCt法进行表达量分析。反应体系中荧光信号达到阈值的循环数为Ct，ΔΔCt＝（Ct实验组目的基因－ Ct实验组管家基因）－（Ct对照组目的基因－Ct对照组管家基因），计算ΔΔCt后再计算2－ΔΔCt值，2－ΔΔCt为miRNA的相对表达比率。

使用SPSS 12.0统计软件，计算资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验，P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

miRNA－21在结直肠癌患者血清（3.64±0.31）中表达明显高于正常人血清（1.02±0.12）（P＜0.05），miRNA－21在结直肠癌组织（7.17±1.46）中表达水平明显高于癌旁组织（2.33±0.84）（P＜0.05），中晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）结直肠癌组织（7.25±0.76）中表达水平明显高于早期（Ⅰ期和Ⅱ期）结直肠癌（3.25±0.24）（P＜0.05）；低分化肿瘤组织（7.18±1.08）中miRNA－21表达水平明显高于中高分化者（3.31±0.68）；有淋巴结转移的结直肠癌组织（7.16±1.14）中miRNA－21表达水平明显高于无淋巴结转移者（3.47±0.84）（见表1）。且发现结直肠癌患者血清中 miRNA－21的表达与癌组织中的miRMA－21表达间存在秩相关关系（见图1）。

表1 miRNA－21表达水平与结直肠癌临床病理参数的关系临床病理参数 n miRNA－21表达水平性别男26 7.12±1.66女16 6.98±1.26年龄＜60岁 27

6.89±1.16》60岁15

7.06±1.62临床分期Ⅰ－Ⅱ 28 3.25±0.24Ⅲ－Ⅳ 14

7.25±0.76病理学分级低分化8 7.18±1.08中高分化34 3.31±0.68淋巴结转移有28 7.16±1.14无14 3.47±0.84

3 讨论

图1 miRNA－21在结直肠癌患者血清中与癌组织中相对表达率关系

大量研究表明，miRNA参与胚胎发育、细胞周期调控、细胞分化增殖与凋亡等重