蛋氨酸

蛋氨酸
1.基本信息：
中文学名：甲硫氨酸或甲硫基丁氨酸俗名蛋氨酸
分子式：C5H11O2NS
结构式：CH3-S-CH2-CH2-CH(NH2)COOH
分子量：149.21
2.理化性质
外观（Appearance）与性状：白色薄片状结晶或结晶性粉末。

有微弱的含硫化合物的特殊气味。

味微甜。

熔点：280～281℃（分解）（L体）；281℃（消旋体）
酸碱性PH：10%水溶液的PH值5.6~6.1。

旋光性比旋度Specific rotation[ ]D
20
：无旋光性。

稳定性：对热及空气稳定。

对强酸不稳定，可导致脱甲基作用。

溶解性：溶于水（3.3g/100ml,25℃）、稀酸和稀碱。

易溶于95%乙醇，极难溶于无水乙醇，几乎不溶于乙醚。

相对密度(水=1)：1.340（消旋体）
3.性状检验
3.1定性鉴别（Idenlification）：
3.1.1取本品25mg于干燥烧杯中，加入由无水硫酸铜饱和的硫酸1ml，应立即显黄色。

3.1.2取一支直径18mm, 长150mm 的具塞试管, 加入蛋氨酸样品5mg, 然后加入5ml
水和2ml 1mol/LNaOH 溶液,摇匀,再加入0.3ml5%( m/V) 亚硝基铁氰化钠溶液( 使用前配制，摇匀, 于35～40°C 放置10min,再在冰浴中冷却2min, 然后加入2ml 1:3 的盐酸, 摇匀, 呈红色为蛋氨酸，静置数分钟, 试管底部有沉淀，上部液体混浊。

3.2酸度测定PH：取本品0.5g，加水50ml溶解后，依法测定，pH值应为5.6～6.1。

3.3溶液的透光度：取本品0.5g，加水20ml溶解后，照分光光度法，在430nm的波长处测
定透光率，不得低于98.0%。

3.4氯化物检验Chloride(Cl)：取本品0.30g，依法检查，与标准氯化钠溶液6.0ml制成
的对照液比较，不得更浓(0.02%)。

3.5硫酸盐检验Sulfate(SO4)：取本品1.0g，依法检查，与标准硫酸钾溶液2.0ml制成的
对照液比较，不得(0.02%)。

3.6铵盐检验：取本品0.10g，依法检查，与标准氯化铵溶液2.0ml制成的对照液比较，不得
更深(0.02%)。

3.7其他氨基酸测定：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，照薄层色谱法试验，吸
取上述溶液5μl，点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)为展开剂，展开后，晾干，在90℃干燥10分钟，喷以茚三酮的丙酮溶液(0.5→100)，再在90℃加热10分钟，立即检视，应只显一个紫色斑点。

3.8干燥失重Loss on drying：取本品，在105℃干燥3小时，减失重量不得过0.2%。

炽灼残渣Residue on ignition
不得过0.1%。

铁盐Iron(Fe)取本品1.0g，依法检查，与标准铁溶液1.5ml制成的对照液比较，不得更深(0.0015%)。

3.9重金属Heavy metals(Pb)取本品0.50g，加水23ml溶解后，加醋酸盐缓冲液
(PH3.5)2ml，依法检查，含重金属不得过百万分之十。

砷盐取本品2.0g，加水23ml溶解后，加盐酸5ml，依法检查，应符合规定(0.0001%)。

3.10热原测定：取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含20mg的溶液，依法检查，剂量按
家兔体重每1kg注射10ml，应符合规定(供注射用)。

有机挥发物
Organic volatile impurities
4.含量（assay）测定
4.1电位滴定法
4.1.试剂：
无水冰醋酸、无水甲酸、高氯酸滴定液（0.1mol/L）、结晶紫指示液、基准邻苯二甲酸氢钾
4.1.2仪器设备：
电位滴定仪
4.1.3试样制备：
4.1.3.1高氯酸滴定液（0.1mol/L）
配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐 5.22mL）750mL，加入高氯酸（70~72%）8.5mL，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。

若所测供试品易乙酰化，则须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%~0.2%。

标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定结果用空白试验校正。

每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。

根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。

4.1.3.2结晶紫指示液
取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解。

4.1.4测定方法：
操作步骤：精密称取供试品约0.13g，加无水甲酸3mL与冰醋酸50mL溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。

每1mL 高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于14.92mg的C5H11NO2S。

4.2化学滴定法
4.2.1试剂：
磷酸氢二钾（K2HPO4）（500g/L）、磷酸二氢钾（KH2PO4）（200g/L）、碘化钾（KI）（200g/L）、0.1mol/L碘溶液、0.2mol碘溶液、0.05mol/LNa2S2O3标准溶液
4.2.2测定方法：
将本品在105℃烘干至恒重，准确称取0.2-0.25g（0.26）（精确到0.0002g）置于500ml 锥形瓶中，加水100ml，磷酸氢二钾（K2HPO4）（500g/L）10ml，磷酸二氢钾（KH2PO4）（200g/L）10ml，碘化钾（KI）（200g/L）10ml，充分振荡溶解后，准确加入0.1mol/L碘溶液50ml（0.2mol、25ml），加塞摇匀，用水冲洗碘塞，并用水封口，在暗处放置30min，用0.05mol/L Na2S2O3标准溶液（滴定过量的碘）至溶液微黄色时，以淀粉作为指示剂，再滴溶液由黑色至无色，同时做空白试验。

4.2.3计算公式
X%= C×（V2-V1）×0.07460×100/m
式中：C----Na2S2O3标准溶液的浓度，mol/L；
V1----试验组消耗Na2S2O3标准溶液的体积，ml；
V2----空白组消耗Na2S2O3标准溶液的体积，ml；
m----试样质量，g。

4.3化学比色法
过量的氯铵-T与蛋氨酸发生氧化反应，生成蛋氨酸亚砜；剩余的氯铵-T 氧化NTB生成DTNB。

当NTB过量时，与氯铵-T反应后剩余的NTB的量在一定范围内，其OD值与加入的蛋氨酸的量成正比。

在氯铵- T为0.03ml，NTB为.2ml，蛋氨酸在7.5～25μ g范围内符合比尔定律，可在412nm处进行比色测定。

其反应过程如下：
蛋氨酸+Ch-T(氯铵-T)→蛋氨酸亚砜
氯铵- T+NTB→ DTNB
4.3.1仪器：
试管, 移液管, 分析天平(0.1mg), 722 型分光光度计
4.3.2试剂：
0.1mol/L的pH=8.0的磷酸盐缓冲液，冷藏保存
0.5mg/ml的EDTA(Augus)溶液，由(1)配制，冷藏保存
0.1mg/ml的蛋氨酸标准溶液，由(2)配制，冷藏保存
0.01mol/L氯铵-T(Sigma- Aldrich)水溶液，冷藏保存
DTNB(5,5' —二硫代双硝基苯甲酸，Sigma)贮液：4mg/ml，由(2)配制，冷藏保存：
NTB溶液（新鲜配制）：DTNB贮液用少量硼氢化钠还原，盐酸溶液中和过量硼氢化钠由，直至无气体产生，磷酸盐缓冲液5～10ml调节pH值至8.0
DEPC(焦碳酸二乙酯)（Sigma）冷藏保存
硼氢化钠(北京化学试剂公司，分析纯)，室温保存
4.3.3标准直线的绘制
(1)取0.1mg/ml的蛋氨酸标准液0，0.075，0.10，0.15，0.20，0.25ml于试管中，EDTA 溶液定容至1.0ml，同时均加入10μlDEPC作为掩蔽剂，室温过夜；
(2)在(1)中加入3.0ml磷酸盐缓冲液和0.03ml的氯铵-T溶液，室温反应40min后，再加入0.2ml NTB溶液，以试剂空白为对照，于412nm下测其OD值，绘制OD—蛋氨酸含量（μ g)标准直线。

参考文献
[1]盛健，蛋氨酸的分析方法
[2]孙晓东，王雅琴.新型蛋氨酸测定方法的建立。

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[3]蛋氨酸的优劣鉴别及其含量测定方法的比较.中国农业科学北京畜牧兽医研究所，赵景鹏聊城出入境检验检疫局韦伟
[4]谭圣君，邵友元，李卫蛋氨酸的研究现状及其应用前景（湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北武汉430068）
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[6]黄光斗，鲁国彬，黄征青，李卫，张智.蛋氨酸的合成机研究进展.（湖北工学院化工系，湖北武汉430068）.化工时刊2003年第17卷第3期化工纵横《Comments&ReviewsinC.1.》[7]王峰，胡世莲.蛋氨酸限制疗法在肿瘤患者中应用的研究进展.（安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院老年科，合肥230001）.中国临床保健杂质2008年4月第11卷第2期Chin JclinHealthc,April2008,V o.11,No.2
饲料中蛋氨酸HPLC检测方法的建立
卢志勇，高学军，黄建国，刘晓飞，李学琳
（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）
摘要：由于饲料水解时蛋氨酸易被氧化，目前还没有较好的测定饲料中蛋氨酸的方法。

试验研究了饲料中蛋氨酸含量测定的方法，将饲料试样按照GB/T18246-2000中酸水解法进行水解和相应的处理，得到氨基酸混合液，与2,4-二硝基氯苯（CDNB）衍生反应后，其中蛋氨酸生成二硝基氯苯蛋氨酸，而蛋氨酸氧化物-蛋氨酸砜生成二硝基氯苯蛋氨酸砜，经高效液相色谱检测，可以完全分离和测定蛋氨酸和蛋氨酸砜。

试验结果表明，高效液相色谱方法克服了蛋氨酸易氧化的问题，可以精确地测出饲料中蛋氨酸的含量。

关键词：饲料；蛋氨酸；蛋氨酸砜；高效液相色谱
中图分类号：S816.8；Q517文献标志码：A文章编号：1001－0084（2010）10－0031－03 酸是饲料中含硫氨基酸，在动物营养上有极大的价值。

蛋氨酸的测定方法多种多样，主要有离子交换色谱法、氨基酸分析法、紫外分光光度法、高效液相色谱（HPLC）检测法等。

但饲料在水解的过程中蛋氨酸会被部分氧化，离子交换色谱法、氨基酸分析法、紫外分光光度法无法准确测出蛋氨酸含量，而常规HPLC检测法在测定时只注重测定水解物中的蛋氨酸，也无法准确计算出蛋氨酸的含量[1]。

本试验通过HPLC对蛋氨酸及蛋氨酸氧化物（蛋氨酸砜）进行柱前衍生，测定饲料中的蛋氨酸含量，从而提高对蛋氨酸检测的准确度，为今后饲料蛋氨酸的检测提供了一种准确可靠的方法。

1·材料与方法
1.1仪器与试剂
仪器：SPD-10A V高效液相色谱仪（日本岛津生产）；N3000色谱工作站（浙江大学提供）；微型漩涡混合仪（上海精科实业有限公司生产）；KQ-500DE型数控超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司生产）；纯水仪（PALL公司生产）。

试剂：DL-蛋氨酸标准品（色谱纯，天津市光复精细化工研究所生产）；DL-蛋氨酸砜标准品（Alfa Aesar，Stock#B25094），其他试剂均为国产分析纯；Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH 9.0）；30 mg·mL-1CDNB溶液（2,4-二硝基氯苯溶液）[2]。

1.2色谱条件
C18不锈钢分离柱YMC（5μm 4.6×150 mm）；流动相：含φ＝30%乙腈的0.01 mol·L-1 NaAC 缓冲液（pH 5.2），取0.01 mol·L-1 pH 5.2 NaAC缓冲液700 mL与色谱纯乙腈300 mL混合，经0.45 mm微孔滤膜真空抽滤，超声脱气；检测波长350 nm；柱温25℃；流速0.8 mL·min-1。

衍生后的试剂经0.22μm滤膜过滤后直接上样，体积10μL，测定其中蛋氨酸含量。

1.3样品液的准备
称取含蛋白质10～20 mg的试样（约50～100 mg，准确至0.1 mg），按照GB/T 18246-2000中酸水解法进行水解。

水解后冷却，混匀，用40%的NaOH调pH到7.0，过滤，用三蒸水反复冲洗离心管和滤器，定容至50 mL，吸取1 mL滤液，待用。

1.4蛋氨酸、蛋氨酸砜和氨基酸水解液的衍生配置含蛋氨酸2、5、10、20、40、60、80μg·mL-1
的蛋氨酸标准液各 1 mL[3]。

分别置于6个20 mL的离心管中，再分别加入pH 9.0 Na2CO3-NaHCO3缓冲液2 mL，混匀后，加入过量的CDNB（1：1.39），用微型漩涡混合仪混匀，置于80℃恒温水浴锅中，避光暗反应1 h，取出，冷却至室温，用0.05 mol·L-1盐酸调pH至7.0，用三蒸水稀释至50 mL容量瓶中定容，混匀。

蛋氨酸砜和氨基酸水解液处理步骤同上。

1.5蛋氨酸含量计算
蛋氨酸的分子式为C5H11O2NS，蛋氨酸砜的分子式为C5H11NO4S，在试样水解过程中，蛋氨酸会部分氧化成蛋氨酸砜，由化学性质可以得出1 mol蛋氨酸氧化生产1 mol蛋氨酸砜，通过物质量的比可准确算出蛋氨酸的总量，见式（1）。

m总=（m1/181.21）×149.21+m2（1）
其中，m1为蛋氨酸砜的质量；m2为蛋氨酸的质量。

1.6饲料蛋氨酸含量的测定
按一定比例将豆粕和玉米蛋白粉进行复配，通过益生菌发酵获得富含蛋氨酸饲料，称取50 mg，按照GB/T 18246-2000中酸水解法进行水解。

2·试验结果
2.1蛋氨酸标准样品衍生后峰形的鉴别和标准曲线的建立
蛋氨酸标准品衍生液HPLC结果见图1，标准曲线见图2。

由图1可见，从左边起第1个峰为CDNB在碱性条件下形成的DNP-OH，第2个峰为经CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸，为目的峰，出峰时间为9.788 min。

以峰面积（μV.s）对进样浓度（μg·mL－1）所得作直线回归，获得回归方程Y=6169.9X-40468。

在进样量为2～80μg·mL-1的范围内，经重复进样，线性系数均在0.9839，在此范围内进样浓度峰面积呈良好的线性相关。

2.2蛋氨酸砜标准样品衍生后峰形的鉴别和标准曲线的建立
蛋氨酸砜标准品衍生液HPLC结果见图3，标准曲线见图4。

图3中从左边起第1个峰为CDNB在碱性条件下形成的DNP-OH，第2个峰为经CDNB 衍生生成的DNP-蛋氨酸砜，为目的峰，出峰时间为8.463 min。

获得回归方程Y=2912.2X-10844，R2=0.9919。

2.3饲料样品衍生图谱分析
饲料样品衍生液HPLC结果见图5。

由图5可知，8.472 min为蛋氨酸砜的目的峰，9.797 min为蛋氨酸的目的峰。

结果表明，蛋氨酸和蛋氨酸砜衍生后目的峰分离良好，把峰面积代入标准曲线中，经计算可以准确的得出饲料中蛋氨酸总量。

本试验选取饲料样品检测结果为每克饲料中含有蛋氨酸163.56 mg。

3·讨论
本试验对蛋氨酸和蛋氨酸氧化物（蛋氨酸砜）进行柱前衍生，并采用HPLC方法准确地测定了饲料氨基酸水解液中的蛋氨酸总量。

目前有两种新型衍生剂6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯（AOC）和2,4-二硝基氯苯（CDNB）[4]。

本试验选取新型衍生剂CDNB，不但价格便宜，易购得，而且能与蛋氨酸和蛋氨酸氧化物生成性质稳定的二硝基氯苯蛋氨酸和二硝基氯苯蛋氨酸砜，而过量的CDNB对试验无影响，线性关系良好。

衍生后经HPLC C18柱分离，UV 350 nm检测，用含有φ＝30%乙
腈的0.01 mo·lL-1 NaAC缓冲液（pH 5.2）为流动相，蛋氨酸和蛋氨酸砜与其他氨基酸分离良好。

本试验研究了饲料中蛋氨酸含量的测定方法，较好地解决了蛋氨酸在酸性水解过程中易氧化难以测定的问题，提高了蛋氨酸测定的准确度，为测定饲料中蛋氨酸含量提供了新的方法。

[参考文献]
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