蛋白质定性定量分析

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等电聚焦测定蛋白质的等电点
等电点分析：电泳结束后三氯乙酸固 定并除去凝胶中的载体两性电解质， 考马斯亮蓝R－250染色，漂洗显带后 测定蛋白质等电点。 1、利用已知等电点标准蛋白质的等电 点为纵坐标，距正极的距离为横坐标 作图得标准曲线，在此标准曲线上根 据待测样品的位置求出其等电点；
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Ve＝K1－K2logMr
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方法的局限性： 1、在pH6～8的范围内，直线关系比 较好，在极端pH时因蛋白质变性而引 起偏离； 2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋 白质的轴比较大时，会引起测定偏离；
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其它蛋白质定性定量分析技术
蛋白质的电泳染色定量分析
特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最 早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋 白的比例测定。其方法有二，其一是将染色 后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比 色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各 峰面积比而得出各成分的相对含量。 与已知含量的标准蛋白一起电泳染色扫描后 与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。
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2、利用微电极直接测定凝胶表面的 pH而得知样品的等电点；
3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块， 浸于水中，用精密试纸测定pH。以凝 胶块距正极的距离为横坐标，pH为纵 坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根 据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋 白质样品的等电点。
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缺点：
1、样品中含有非蛋白态氮时影响分析结 果； 2、组成蛋白质的氨基酸可影响分析结果；
3、操作复杂，对操作者的要求高。
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Lowry法 Lowry法原理：是在双缩脲法和Folin 酚法的基础上建立的一种新的蛋白 质定量方法。蛋白质在碱性条件下 与铜离子反应生成紫红色络合物。 然后再与Folin试剂反应生物深蓝色。 颜色与蛋白质含量成正比，符合朗 伯－比尔定律。
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4、计算相对迁移率：
蛋白样品移动距离(cm)
Rf= 指示染料移动距离(cm)
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凝胶过滤测蛋白质分子量：测定大分子 的分子量是凝胶过滤的应用之一。将已 知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱 上以相同条件进行过滤层析，由于加入 凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积 也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配 常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之 间又存在线性关系，利用这一关系可绘 制出Kav与分子质量的标准曲线。
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方法评价
优点 1、可对多个样品同时进行分析，操作简便； 2、结合Folin酚法，提高了分析的灵敏度； 3、结合双缩脲法，避免了Folin酚法的局限。
缺点 1、比色测定，要求显色后溶液透明，且样品必 需可溶； 2、酚方式剂在碱性溶液中稳定性差，显色后需 尽快比色； 3、干扰反应的因素较多。
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考马斯亮蓝G-250染色法
原理：考马斯亮蓝在一定浓度的乙醇和酸 性溶液中呈现红色，与蛋白质结合后变为 蓝色，最大吸收峰从465nm移到596nm。 优点： （1）操作简便；（2）敏感度较高 （3）颜色稳定（4）对干扰剂不敏感。
缺点： （1）染料与蛋白质的实际状况复 杂，色素与样品中的蛋白质不一定以当量 相结合；（2）要求样品完全溶解；（3） 样品不能回收使用。
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A
0.8 0.6 0.4
0.2
0
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0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 mg/ml
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紫外吸收法
原理：蛋白质在紫外区有两个吸收峰， 其一为280nm，由芳香氨基酸上共轭双 键引起，芳香氨基酸在各种蛋白质的的 含量差别不大，测蛋白质溶液在280nm 处的吸收值可计算出样品中蛋白质的含 量。蛋白质第二紫外吸收峰在240nm以 下，215nm最大，此峰是肽键引起。可 通过215nm与225nm的差值计算出蛋白 质的含量。
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lgMr=lgK-bm=K1-bm
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SDS-PAGE法测定分子量的操作：
1、标准蛋白质样品的制备：按商品 说明书使用。
2、待测样品的制备：取待测蛋白质 样品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸缓 冲液(pH7.0)1ml溶解。与标准蛋白质 一起加入等体积的样品缓冲液，混匀， 沸水浴加热3分钟后上样。 3、电泳分离及染色：
转变为硫酸铵。
Pr＋H2SO4
CO2＋H2O＋(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+HCl
NH4OH+H2SO4 NH4Cl+H2O
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凯氏法的评价： 优点：
1、适用于一切形态的样品； 2、不用比色，对混浊不透明的样品也可 进行分析； 3、结果的精、准度较高。
3、糖蛋白的含糖量大于5％时，测得 的分子量比真实分子量大。
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沉降速度法百度文库
S＝ 沉降速度 ＝ dx/dt ＝ 1 dx
离心力 ω2x
dtω2 x
SRT m=
D(1-υρ)
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沉降平衡法 2RTln(C1/C2)
m= (1-υρ)ω2(X22-X12)
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蛋白质的含量测定
凯氏定氮法：1883年丹麦化学家 Kjeldhl建立，经后人改良后形成的一 种定量测定蛋白质最为精确、敏感的 方法。 原理：蛋白质的含氮量为16％，只要 测出样品中氮的含量，即可计算出蛋 白质的含量
样品中蛋白质的含量＝N×6.25
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凯氏定氮的基本流程： 1、消化：生物样品与浓硫酸共煮， 样品蛋白质被无机化，其中氮元素
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蛋白质相对分子量的测定
SDS－PAGE法测蛋白质的相对分子 量：带电颗粒在电场中的迁移主要受 三个因素的作用，即场强、颗粒本身 的电荷及分子形状。因此一般电泳无 法直接测定蛋白质的分子量。加入变 性剂SDS后，蛋白质变性肽链伸展且 蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖， 在相同的电场下，蛋白质的迁移率只 与蛋白质的分子量相关。