单分子检测技术

图二、三甲胺甲基二茂铁的分子检测
单分子检测技术的应用及展望
应用
单分子荧光检测在化学分析、DNA测序、纳米材料分析、医学诊断、法医分析、单DNA操纵、 活细胞分析、分子动力学机理等方面都具有独特的应用价值，对许多学科领域的发展产生了 和正在产生着深远的影响。单分子水平上的生物分子研究，揭示了生物大分子的结构和功能， 单分子荧光检测尤其在生命科学中具有广阔的应用前景，为生命科学提供了新的研究手段。
受激发射损耗显微镜技术
突破光学衍射极限的办法之一是近场光学 显微镜，它是利用探针探测样品表面的隐 失场而获得样品表面信息。受激发射损耗 （STED)荧光显微术是一种可以突破光学衍 射极限的远场光学显微术，是一种有效的 光学超分辨方法。通过引入一束损耗光以 受激发射的方式来抑制有效荧光的发射， STED可以实现超衍射极限的分辨率。自 1994年被提出以来，STED技术经过各方面 的改进与发展，正在变得日益的完善与成 熟。同时，STED显微术在生物医学、材料 学等领域中的多功能应用也推动了这些领 域的快速发展。
消失波激发
在玻璃 -液体 /空气界面的全内反射 产生指数衰减的消失场 ,在界面薄层 ( ～ 300 nm)上的分子可被消失波激 发。消失波单分子成像的全套装置类 似于倒置荧光成像, 唯一不同的是它 的激发光束从物镜另一侧直接射向样 品。消失波激发视野比较宽 , 但样品 厚度非常薄, 与其它方法相比,具有更 低的背景信号 ,是一种应用比较广泛 的单分子荧光检测方法。
单分子探测方法（重点）
倒置荧光显微镜
倒置荧光显微镜是比较常见的光学仪器, 在普通的倒置荧光显微镜上添加一些简 单的附件,便可用作单分子检测 。光学系 统主要包括以下部分 :激光光源 、散焦光 学装置 、双色光束分离器和油浸物镜。 配以电感耦合器件 (CCD)或增强型电感耦 合器件(ICCD),则可进行高灵敏检测。
单分子探测方法（重点）
目前可用于单分子检测的研究方法主要有 3大类 : 1光学方法,包括扫描近场光学显微镜 (scanningnear-fieldoptical microscope, SNOM)、 表面增强拉曼光谱共聚焦荧光显微法、 (confocalfluorescencemicroscopy)、受激发射损耗显微镜技术 (stimulated emission depletion,STED)、随机光学重建显微法 (stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)等 2扫描探针显微方法, 包括扫描隧道显微镜 (scanningtunnelingmi_x0002_croscopy, STM)等 3化学方法,包括电化学检测 (singlemoleculeelectrochemicaldetection, SMED)、化学发光 (chemiluminescence, CL)检测等 。
STORM原理图
单分子探测方法（重点）
2、扫描探针显微方法
扫描探针技术通过观察隧道电流 、分子间 作用力等物理量获得样品的物理性质, 同时 能达到原子级的分辨, 成为研究单分子化学 和物理的重要技术手段 。扫描探针显微镜 （SPM）主要包括扫描隧道显微镜（STM） 和原子力显微镜（AFM）两种功能，这两 种方法或为补充。 STM要求被测样品必须是导体或半导体， 虽然不导电的样品可以通过镀金膜或碳膜 在其表面形成一层导电膜，但膜的粒度和 均匀性直接影响对真实表面的分辨率造成 失真。AFM可用于非导体，但要求样品的 粘度不能太大，否则将直接影响分辨率。 图1 STM系统的基本结构示意图
单分子检测技术
Single-molecule detection technology
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单分子探测技术介绍 单分子检测方法（重点） 单分子检测技术的应用及展望
单分子检测技术介绍
简介
单分子检测 (singlemoleculesdetection, SMD)方法是在 20世纪 80 年代伴随着扫描隧道 显微镜和近场扫描的发展而迅速发展起来的, 检测 灵敏度达到分子水平的一系列高灵敏检测技术 。 SMD的检测空间尺度在纳米数量级,检测的分子数 目或相关事件一般在几个(次)到几千个(次)的范围。 单分子检测做为针对有限可数的化学微观个体性 质和行为的测量分析方法, 能够提供用传统的宏观 测量方法得不到的分子微环境中微观个体信息, 受 到广泛关注。
可以研究材料表面的硬度、摩擦力、粘滞力、弹性等力学性能；研究原子与分子形貌、材 料表面的形貌、粗糙度以及各种缺陷‘可以测量材料的电、磁特性以及热传导特性；可应用 在生命科学方面，还可以进行纳米测量、纳米刻蚀与加工
其他一些应用包括：检测非均匀聚集体中的单个分子；识别、分类和定量描述单分子；对 化学反应的途径进行实时监测
单分子探测方法（重点）
随机光学重建显微法
随机光学重建显微法(STORM) 是一种将荧光光谱和显 微分析技术应用于单个分子之上的崭新的物理手段， 其是一种比传统光学显微镜高10倍以上分辨率的新型 显微技术。利用可光转化荧光分子的开关，对其准确 定位，然后重建荧光图像。STROM成像过程包含一系 列图像循环。每个循环中，只打开视野下一部分荧光 基团，这样每个活跃的荧光集团都被分辨，它们的图 像与其他分子分开，不重叠。这样确定了基团的准确 位置，多次重复这个过程，每次随机打开荧光基团的 不同亚基，得到图像，确定每个亚基的位置后，把以 上图像重建成清晰的整个图像。以下的例子中，研究 者们获得20nm左右的分辨率。
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Author: 罗四维
单分子探测方法（重点）
近场扫描光学显微镜
普通光学显微镜因为光的衍射现象其分辨 率受光波波长的限制 ,而近场扫描光学显微 镜则突破了光学衍射的极限 。所谓近场是 指光源与样品间的距离接近到纳米水平, 而 且光源通过针孔甚至光纤的尖端加以限制, 分辨率不再决定于波长,而由光源尺寸和光 源 -样品的间距决定, 因而可以达到几十纳 米的分辨率。 近场扫描光学显微镜的优点是具有较高的 分辨率 , 已被用来研究单分子对荧光共振能 量转移以及单分子荧光成像。但有输出功 率低、针尖制备的重复性较差wk.baidu.com及镀膜针 尖对样品的探测会产生干扰等缺点。
单分子检测技术的应用及展望
展望
随着 SMD方面研究的飞速发展 ,人们已将研究方法从宏 观的统计分析扩展到对微观个体的离散研究 ,已将研究 的对象从简单的体系推广到更为复杂的生物体系,力图 解决生命科学中的重大问题 。目前 SMD的研究已经涉 及到物理、化学 、生命科学、医学、信息科学 、电子 学等众多学科的前沿领域。随着单分子科学的发展， 越来越多的物理效应和各种应用将被揭示出来。单分 子操作技术方兴未艾 , 把这项技术应用到有创意的实 验中去, 有可能带来意想不到的实验结果。
这些方法实现单分子检测的共同特征是: (1)高空间分辨能力; (2)单分子性质和行为的捕获能力 (3)能收集微弱信号并放大检测, 并做相应 的分析处理以获取可信的信息 。
单分子探测方法（重点）
1、光学方法
单分子的光学探测可由频率调制的吸收光谱和激光诱导荧 光检测 ,因其背景低 、信噪比高, 激光诱导荧光成为单分 子检测最常用的方法 。 单分子荧光检测的技术关键在于确保被照射的体积中只有 一个分子与激光发生作用以及消除杂质荧光的背景干扰。 采用高效滤光片 ,利用共焦 、近场和消失波激发 ,可达此 目的。根据所用仪器及对样品激发方式的不同, 单分子荧 光检测大体可分为以下几种：
远场共焦显微镜
在共焦显微镜中, 利用高数值孔径油浸物 镜把激光束聚成衍射极限大小的焦点 ,在 像平面处放置一个直径为 50 μm ～ 100 μm 的共焦小孔来阻挡焦点外的光 。荧光 信号经共焦小孔后被探测器接受 , 而非焦 平面的光则被共焦小孔过滤掉。尽管它的 分辨率受衍射极限的限制, 远场共焦具有 激发强度不受限制 、非侵入式检测 、灵 敏度高及操作简单等优势 ,非常适合于研 究单个给体和受体间的荧光共振能量转移。
单分子探测方法（重点）
3、电化学方法
进行单分子的电化学检测有两个前提条件 : (1)要能独立检测发生在纳米尺度空间的反应变化, 实现对 有限个数分子的捕获 。对此目前主要有两种途径, 或是使 用纳米微电极仅对电极附近纳米尺度空间溶液中的可数 分子进行电化学检测 ;或是利用极快速的电势扰动技术 , 使扩散层仅限于纳米尺度的范围 (2)需要把反映单分子行为的微弱信号放大到可以检测的 程度。 优点 在众多单分子检测方法中 ,电化学方法具有独特的优 点 ,即一种直接的几乎不影响被测对象的检测方法 。 检测的是分子本身的电荷变化, 而其他方法往往是间接 的 、测量方法对研究对象有较大影响作用 、需要外部 标记的方法, 而且电化学方法还是一种适合和其他方法 联用的方法, 因而引起了广泛关注,得到初步发展。