猪增生性肠炎PCR诊断方法的建立

【 要 】本 试 验 建 立 了 Ｐ Ｅ 实验 室诊 断 方 法 ， 以快 速 准 确 地检 测 到 舍 有 ４ ｇ ｌ 样 品 总 Ｄ Ａ 模 板 ， Ｃ 扩 摘 Ｐ 可 ５Ｐ 的 Ｎ ＰＲ
增 能获 得 ２ ０ｂ 特 异性 条 带 ， Ｇ ｎ ａ ｋ上 公 布 的 Ｐ Ｅ ＭＮ１ ０株 相 应 片段 的 核 苷 酸 序 列 进 行 同 源性 分析 ， 源 ０ ｐ 与 ｅＢ ｎ Ｈ ／ —０ 同
下 未 出现 明 显 病 症 的 猪 ， 成 的 损 失 容 易 被 忽 视 。但 是 ， 造 禁 止 使 用 抗 生 素 后 ， 增 生 性 肠 炎 可 能 成 为 一 种 重 要 的 流 行 疾 猪 病 ， 而 引 起 养 猪 户 的 经 济 损 失 。因 此 ， 必 要 了解 Ｐ Ｅ的 从 有 Ｐ 流行情况 ， 防制该病提供理论依据 。 为
主 菌为 Ｅ．ｏｌ ｃ ｉＤＨ５ ， ａ 由本 实 验 室 保 存 ； 脂 糖 购 自上 海 赛 百 琼
提 取 质 粒 ； Ｂ ｍＨ ＩＳｌ 用 ａ ／ ａＩ酶 切 鉴 定 重 组 质 粒 ； 阳性 重 组 对
质粒 测 序 鉴 定 并 与 Ｇ ｎ ａ ｋ收 录 的 Ｐ Ｅ进 行 同 源性 比较 。 ｅＢ ｎ Ｐ
《 海 畜牧 兽 医通讯》 ２ １ 上 ０ ０年 第 ４期
・ ７ ・
猪 增 生性 肠 炎 Ｐ Ｒ 诊 断 方 法 的 建 立 Ｃ
张 邑 帆 付 利 芝 杨 睿 沈 克 飞 郑 华 游 斌 杰
（重 庆 市 畜 牧 科 学 院 兽 医 研 究 所 荣 昌
４２ ６ ） ０４ ０
性 为 ９ ．０ ， 明 扩 增 产 物 是 特 异 性 的 目的 片段 。 ９５％ 表
关 键 词 ：猪 增 生 性 肠 炎 ； Ｃ ； 测 ＰＲ 检
猪 增 生 性 肠 炎 （ ｏ ｃ ｅｐｏ ｆｒｔ ｅｅ ｔ ｉｓ Ｐ Ｅ 是 由胞 ｐ ｒｉ ｒｌｅａｉ ｎｅ ｔ ， Ｐ ） ｎ ｉ ｖ ｒｉ 内 劳森 氏菌 引 起 的猪 的 接 触 性 传 染 病 。该 菌 可 导 致 猪 肠 道 功能 严 重 损 坏 、 泻 、 出 血 ， 增 厚 的 黏 膜 阻 碍 营 养 吸 收 ， 腹 肠 而
２ ０ｂ 的特 异 条 带 。然 后 在 １ Ｉ 系 中 分 别 加 入 ２ 回 收 ０ ｐ ０ 体 ｌ
产 物 、 ｌ ｅ ａｉ ｏｕ ｉ １ ５ ｇ ｔ ｎ Ｓ ｌｔ ｎ Ｉ、 Ｌ来自百度文库ｏ ｏ ｐ ＭＤ一 １ Ｔ 载 体 ， ｌ ８ ２
ｄＨ Ｏ，６℃ 水 浴 １ ｄ２ １ ８ｈ后 取 出 ， 化 大肠 杆 菌 Ｄ ａ３ 转 Ｈ５ ，７℃ 倒
进 而 引起 体 重 减 轻 ， 至 造 成 死 亡 。该 病 呈 全 球 性 流 行 ， 甚 丹 麦一 些 大 型 规 模 化 猪场 完 全禁 止使 用 抗 生 索 后 ， 多 曾经 没 许
有发 病 史 的 猪 场 ， 现 猪 增 生 性 肠 炎 明 显 症 状 的 病 例 增 出
多 【 。 当前 ， 内猪 场 普 遍 长 期 使 用 抗 生 素 ， 抗 生 素 作 用 １ ］ 国 在
ｍ ｒ ｅ 、 Ｃ２ 蛋 白 酶 Ｋ、 和 酚 购 自上 海 生 工 ； 氯 甲 烷 ａｋ ｒＭｇ ｌ 、 饱 三
（ 析 纯 ） 广 东 汕 头 市 光 华 化 学 厂 产 品 ； 戊 醇 为 广 州 化 学 分 为 异
试剂二厂产品 ； 水 乙醇 为广东 汕头 市西 陇化工 厂产 品 ； 无 宿
置 培 养 １ 。 ２ ｈ
１ ６ 阳 性 重 组 质 粒 的 筛选 及 酶 切 、 序 鉴 定 ． 测
用接 种环 挑 取 上 述 转 化 平 皿 中 的 白色 单 克 隆 菌 落 ， 种 接
到含 Ａ ｍｐ的 Ｌ Ｂ液 体 培 养 基 中 ， Ｔ 振 荡 过 夜 至 混 浊 ，然 后 ３＇ Ｃ
１５ Ｐ ． ＣＲ 产 物 的 克 隆
Ｐ Ｒ产 物 经 １ ２ Ｃ ． ％琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 胶 成 像 系 统 观 察 凝 结 果 。 使 用 ＤＮ 凝 胶 回 收 试 剂 盒 回 收 琼 脂 糖 凝 胶 中 约 Ａ
１ 材 料 与 方 法 １ １ 材 料 ．
（ ） 器 ：Ｃ 仪 （ Ｂ ）、 胶 成 像 分 析 系 统 （ ｌｈＭａ— １仪 ＰＲ Ａ Ｉ 凝 Ａｐ ａ ｓ
ｔｒ 高 速 冷 冻 离 心 机 （ ｐ ｅ ｄ ｒ） （ ） 剂 ： ＮＡ 片 断 回 ｅ ）、 Ｅ ｐｎｏｆ。 ２ 试 Ｄ 收试 剂 盒 、 粒 小 量 提 取 试 剂 盒 等 购 自 Ｔ Ｋａ ａ公 司 （ 质 ａ Ｒ 大
连 ） Ｔａ 酶 、 ｆ ｒ ｄ ； ｑ Ｂｕｆ 、 ＮＴＰ 、 ０ ０ ＤＮＡ ｒ ｅ 、 ０ ０ ｅ ｓ ２０ ｍａｋ ｒ ５ ０ ＤＮＡ
１４ Ｐ ． ＣＲ 扩 增
Ｐ Ｒ 反应 体 系 ２ ｌ１ ×Ｂ ｆ ｒ２ ５ｔ ， ａ Ｃ ５ ： ０ ｕ ｅ ． ｄ Ｔ ｇ酶 （ １ １Ｕ ）
１ ｌ上 下 游 引 物 各 （ ０ ｐ ｌ １ ， Ｎ ， １ Ｍｏ ）１ ｄ ＴＰ 混 合 物 （ 各
ｄ Ｔ Ｎ Ｐ含 量 ２ ５ ｍＭ ） ｌＭｇ ｈ Ｍ 终 浓 度 ２ ． ２ ， Ｃ （ ５ ｍＭ） ｌ ２ ， 模 板 Ｄ ｌ加 去 离 子 水 至 ２ 。Ｐ Ｒ反 应 条件 ： ４ 预 ＮＡ ３ｕ ， ５ Ｃ ９℃ 变 性 ７ ｍ ｎ ９ ℃ 变 性 ６ ，６ 退 火 ６ ， ７ ℃ 延 伸 ９ ， ｉ，４ ０ｓ ５ ℃ ０ｓ 再 ２ ０ｓ 循环次数 ３ ０个 循 环 ， 后 ７ ℃ 延 伸 １ ｎ ４ 保 存 。反 应 最 ２ ０ ｍｉ ， Ｅ 结 束 后 取 ７ Ｃ 产 物 用 １２ ｌ Ｒ Ｐ ． ％琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 观察 。
１ ７ Ｐ Ｒ 方 法 的 敏 感 性 检 测 ． Ｃ