一种黑曲霉斜面培养基的优化方法

一种黑曲霉斜面培养基的优化方法

摘要:通过一系列实验,优化了黑曲霉Co827的斜面培养基配比。优化后的斜面培养基为3.5°Be～3.6°Be麦芽汁培养基。采用优化后的培养基,单菌落孢子数达到167.2×105左右,产孢子能力提高了15.07%,通过摇瓶验证,产酸达到14.40%,提高了3%左右。

关键词:黑曲霉Co827 斜面培养基麦芽汁优化

黑曲霉Co827是目前国内大多数柠檬酸厂家广泛使用的菌种,该菌种尤其适合以木薯干、玉米等淀粉质原料的发酵[1,2]。该菌种的扩大培养普遍采用小试管斜面培养—大试管斜面培养—三角瓶培养—钢瓶—种子罐五级培养方式,然后接入大发酵罐发酵。其中,斜面培养阶段提供的是大量的孢子,此阶段孢子着生的旺衰直接影响后续菌种活力乃至大罐发酵水平[3]。衡量孢子着生旺衰(行业内成之为活力)的指标是单菌落孢子数和可转接大试管数,然后检测摇瓶产酸酸度加以验证。目前国内大部分采取清液发酵技术的厂家普遍采用的培养基是3.0°Be麦芽汁[4]或土豆汁培养基,部分厂家在培养基里还添加营养盐。目前国内厂家黑曲霉Co827单菌落孢子数约在145×105～146×105,摇瓶酸度约14.0%左右。笔者在本实验中利用显微镜观察不同组分的斜面培养基上黑曲霉菌落形态,进而测得单菌落孢子数,找出最优配方和浓度,并在摇床上培养96 h测得摇瓶酸度进行验证。

1 材料和方法

1.1 菌种

黑曲霉Co827,菌落生长较快,菌落凸起,边缘整齐,菌落较小,带皱折,培养4天孢子呈黑色。96 h摇瓶产酸14.0%。

1.2 培养基

1.2.1 平板培养基

(1)麦芽汁培养基:2.0°Be～6.0°Be麦芽汁,琼脂1.7%,pH自然。

(2)麦芽汁营养盐培养基:3.0°Be麦芽汁,MgSO4.7H2O 0.15%、K2HPO40.36%,(NH4)2SO4 0.2%,琼脂1.7%,pH自然。

(3)土豆汁培养基(PDA):土豆汁,葡萄糖2%,琼脂1.7%,pH自然。

（4）土豆汁营养盐培养基:土豆汁,葡萄糖2%,MgSO4.7H20

0.15%,K2HPO40.36%,(NH4)2SO4 0.2%,琼脂1.7%,pH自然。

1.2.2 发酵摇瓶培养基

玉米粉液化液15%,玉米液化液清液85%,pH自然。

1.3 主要仪器及设备

超净工作台(安徽省航天净化设备有限公司)。

血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)。

恒温培养箱(杭州蓝天化学仪器厂)。

恒温摇床(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)。

显微镜(上海光学仪器六厂)。

恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1平板培养方法

将菌悬液用玻璃珠打散后摇匀,用吸管取0.1 ml滴入制作好的不同培养基的培养皿中,35 ℃培养96 h。

1.4.2 摇瓶培养方法

250 ml三角瓶内装有消好的摇瓶培养基40 ml,将菌种自平板挑入三角瓶中,放入摇床,35 ℃,300 r/min转速下培养96 h。

1.5 平板上菌落孢子计数

取100 μl灭菌水冲洗孢子,吸出孢子菌悬液至于EP(eppendorf)管中,取1 μl滴于载玻片上,轻轻盖上盖玻片,不要有气泡,然后在血球计数上查数孢子。

1.6 摇瓶酸度测定[5]

取1 ml摇瓶发酵液,以酚酞作为指示剂,以0.1429～0.1430 mol/L

NaOH溶液滴定至淡粉红色,所消耗的NaOH毫升数即为摇瓶酸度。

2 结果与分析

2.1 最优培养基组分的确定

分别采用不同波美度的麦芽汁、麦芽汁营养盐、土豆汁、土豆汁营养盐作培养基,将黑曲霉生产菌种培养96 h,在显微镜下观测菌落生长情况。采用不同培养基96 h菌落形态如图1所示。

从图1可以看出,3.0°Be麦芽汁培养基和4.0°Be麦芽汁培养基上菌落形态规整,颜色较深,边缘清晰,长势较为旺盛。

将每个培养基做三个平行样品,测定小试管中每个各个菌落的孢子数,取平均值。然后,将小试管中菌落转接进大试管。测定结果见表1。

从表1可以看出,3.0°Be及4.0°Be麦芽汁培养基的单菌落长孢子数分别为148.3×105和127.3×105,且可转接大试管数均为30。所以,可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麦芽汁培养基为较优培养基,最为适合Co827的生长。

2.2 最优培养基浓度的确定

为了进一步确定最优麦芽汁浓度,以0.1°Be为一浓度梯度,每一梯度培养基做三个平行样,测定单菌落孢子数,然后将单菌落接入三角瓶进行摇瓶发酵(起始糖液总糖为14.9%),测定96 h摇瓶酸度和96 h还原糖值,取三个平行样的平均值。测定结果如表2所示。

由表2可以看出,随着麦芽汁浓度的升高,单菌落孢子数逐步上升,3.5°Be～3.6°Be时达到峰值,为167.2×105左右,此后逐步下降。因此可以结论,3.5°Be～3.6°Be为最优麦芽汁培养基浓度。

同时,从表2中可以看出,3.5°Be～3.6°Be时,14.40%左右的摇瓶产酸也为最高,而还原糖降低到0.50%～0.51%左右,说明糖酸转化率也较高。这一点再次证实了孢子数越多,菌种活力越强,产酸能力越高[7],证实了3.5°Be～3.6°Be为最优麦芽汁培养基浓度。

3 结论

采用3.5°Be～3.6°Be麦芽汁培养基,单菌落孢子数达到167.2×105左右,产酸为14.40%左右,相对于现生产上普遍使用的3.0°Be麦芽汁培养基,产孢子能力提高了15.07%,摇瓶产酸提高了3.1%左右,这对于提高后续菌种活力,提高产酸水平,降低柠檬酸的生产成本具有重要意义。

参考文献

[1] 姚汝华.微生物工程工艺原理[M].广州:华南理工大学出版