第二章 菌种的来源 (新)

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问题： 问题：
生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生 微生物（包括动、植物细胞） 产我们所需的一切产品， 产我们所需的一切产品，但是涉及到工业 化生产对于某一种特定的产品， 化生产对于某一种特定的产品，只有特 才具有大量表达的潜力。 定的微生物才具有大量表达的潜力。
基因的直接进化： 基因的直接进化：
点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等
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四、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、 (1977 枯草牙胞杆菌沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞) 酵母(既是微生物又是真核细胞)
谷氨酸发酵的菌种：
棒杆菌属，短杆菌属、 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属 或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 其它氨基酸生产菌：
常规菌种一般也是以谷氨酸生 产菌选育而成；工程菌， 产菌选育而成；工程菌，大肠 杆菌， 杆菌，枯草芽孢杆菌
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三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。 FDA的批准 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已 同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草 淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、 牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌
脆壁酵母、 黑曲霉、 脆壁酵母 、 黑曲霉 、 米曲霉和枯草 作为食用无须作毒性试验外， 杆菌等作为食用无须作毒性试验外，其他微
生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
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四、生产选种
是在长年累月的生产实践中， 是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条 件没有任何可见变更情况下， 件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次 生产水平提高较大， 生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异 朝更好的方向变的细胞， 朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于 培养条件，并逐渐显示出它的生长优势， 培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优 势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类 势的发展，促使它优良的生产性能表露。 似新种筛选分离， 似新种筛选分离 ， 达到获得 新的优良生产 的目的。 菌种的目的。
二、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表 的代谢控制发酵，是发酵工业发 展历史上的一个转折点
人工诱变的方法， 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地 人工诱变的方法 改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物， 改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发 酵形象地称为代谢控制发酵， 酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到 成功应用。 成功应用。
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采样时要注意的问题
气候、水分、 气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、 标签：地点、时间、气候等
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从自然界筛选
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采样季节：以温度适中， 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋
初为好。 初为好。
采土方式：在选好适当地点后， 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨
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（四）筛 选
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验， 件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以 求得适合于工业生产用菌种。 求得适合于工业生产用菌种。
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（五）毒性试验
自然界的一些微生物是在一定条件下产毒 将其作为生产菌种应当十分当心， 的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与 食品工业有关的菌种，更应慎重。 食品工业有关的菌种，更应慎重。 据有的国家规定， 啤酒酵母、 据有的国家规定 ， 微生物中除 啤酒酵母 、
微生物的特性及工业微生物的要求 一些工业化产品生产菌种的特点 自然界中有目的微生物分离 菌种选育、 菌种选育、分子育种 菌种衰退与复壮
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第一节 微生物的特性及工业微生 物的要求
一、微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
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三、新种分离与筛选的步骤
长培养特性。 长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 采样：有针对性地采集样品。
定方案：首先要查阅资料， 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需 增殖：人为地通过控制养分或培条件，
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 分离：利用分离技术得到纯种。
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第二节 已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下： 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
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目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：
让目的微生物在种群中占优势， 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。 得可能
富集的三种方案： 富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 定向培养: 条件，进行培养。 条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时， 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， 类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
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第四节
工业菌种的育种方针－－ 工业菌种的育种方针－－
菌株选育、 菌株选育、分子改造
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目的
防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品
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方法
基因突变： 基因突变： 基因重组： 基因重组：
自然选育、诱变育种
杂交、原生质体融合、基因工程
发酵性能测定： 进行生产性能测定。 发酵性能测定 ： 进行生产性能测定 。 这些特
（一）采样
1、采样对象
为主。 以采集土壤为主。 一般园田土和耕作过的沼泽土中， 一般园田土和耕作过的沼泽土中 ， 以细菌 和放线菌为主 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中， 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中 ， 酵母 和霉菌较多， 和霉菌较多 ， 如一些野果生长区和果园 内。 采样的对象也可以是植物，腐败物品， 采样的对象也可以是植物 ， 腐败物品 ， 某 些水域等。 些水域等。
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（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著， 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微 生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步 在这 步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、 分离的方法有划线分离法 、 稀释分离法 。
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（二）增殖培养
为了容易分离到所需的菌种， 为了容易分离到所需的菌种 ， 让无关的微生 物 至少是在数量上不要增加 ， 可以通过 配制选择性培养基， 配制选择性培养基 ， 选择一定的培养条件来控 制。 例如碳源利用的控制， 可选定糖， 淀粉、 纤 例如碳源利用的控制 ， 可选定糖 ， 淀粉 、 维素， 或者石油等， 以其中的一种为唯一碳源， 维素 ， 或者石油等 ， 以其中的一种为唯一碳源 ， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。 生长 ， 而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
子除去表土， 取 离地面 5-15cm 处 的土约 cm处 子除去表土 ， 离地面5 15cm 的土约10g， ， 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记， 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。 记录采样时间 、 地点 、 环境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化， 为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化 ， 宜 将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40 花了10年的时间从 万株微生物中， 万株微生物中，发现了三种有潜力的新 抗生素。 抗生素。
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第三节 自然界中有目的微生物分离
一、菌种分离的一般过程
土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择
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二 工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基， 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效 地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单， 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种 改造的可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（ 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好 与致病菌无关） 与致病菌无关） 生产特性要符合工艺要求
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
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中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞） 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统 细胞
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
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AK:天冬氨酸激酶 天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶 高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异 亮氨酸的合成调节机制
氨基酸生产菌的要求： 氨基酸生产菌的要求：
代谢途径比较清楚， 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
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定向培养的方法
物理方法： 物理方法：加热、膜过滤等
但主要是通过培养的方法
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定向培养的富集方法
1、底物 3、培养时间 pH条件 2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 度的手段，培养（固体、液体； 连续） 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
性包括形态、 培养特征、 营养要求、 性包括形态 、 培养特征 、 营养要求 、 生理生化 特性、 发酵周期、 产品品种和产量、 特性 、 发酵周期 、 产品品种和产量 、 耐受最高 温度、生长和发酵最适温度、最适pH值 温度、生长和发酵最适温度、最适 值、提取 工艺等。 工艺等。 2011-6-27 16
→ 产品的鉴定
目的： 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 问题：
如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现
二、分离思路
新菌种的分离是要从 混杂的各类微生物 中依照 生产的要求、 菌种的特性， 采用各种筛选方法， 生产的要求 、 菌种的特性 ， 采用各种筛选方法 ， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎 污染了杂菌 ， 也必 须重新进行分离纯化。 须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。 理先进的设备与之配合。