生物丁醇代谢工程的研究进展
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当丙酮生 成 途 径 被 阻 遏 后，酸 吸 收 能 力 减 弱， 产醇能力相应被削弱。Jang 等［13］将通过酸吸收产 醇的途径称为冷通道（ cold channel） ，将乙酰辅酶 A 到丁酰辅酶 A 然后生成丁醇的途径称为热通道（ hot channel） 。将酸产生途径中的 pta 基因和 buk 基因 进行了双敲 除，增 强 热 通 道 的 代 谢 流，同 时 表 达 醇 脱氢 酶 adhE1 的 突 变 体，该 突 变 体 对 NADH 和 NADPH 都有很好的亲和力，从而增强了对热通道的 驱动力。该研究中丁醇的产量提高到了 18. 9 g / L， 对葡萄糖的转化率达到 31. 2% 。相对于野生型菌 株，这 2 个指标分别提高了 160% 和 245% 。这也是 迄今为止通过代谢工程手段获得的丁醇产量和转 化率最高的丙酮丁醇梭菌突变体。
更高的能量 密 度，更 强 的 疏 水 性，同 时 不 具 有 腐 蚀 性，可以延 长 运 输 管 道 的 使 用 寿 命，可 以 直 接 使 用 而无需改造现有的动力引擎［1］。所以近年来，利用 生物法生产丁醇受到人们的普遍关注。
ABE（ acetone-butanol-ethanol） 发酵是生物法生 产丁醇的最主要方法，这一方法已经有近百年的历
化石能源的不断减少及环境问题的日益加重， 迫使人 们 寻 找 可 持 续 的 方 法 来 维 持 世 界 的 发 展。 利用可再生资源生产石油基化学品是一种重要的 可持续发展途径。丁醇作为一种大宗化学品，既是 生产许多化合物的重要原料，也是一种潜在的动力 燃料或者燃料添加剂。相对于燃料乙醇，丁醇具有
第2 期
戴宗杰等： 生物丁醇代谢工程的研究进展
59
史。工业上用来生产丁醇的菌株主要有丙酮丁醇梭 菌 （ Clostridium acetobutylicum ） 、拜 氏 梭 菌 （ C． beijerinckii、 C． saccharoperbutylacetonicum 和 C． saccharobutylicum） 等菌株，其中对丙酮丁醇梭菌的研 究最为深入。1992 年，Mermelstein 等［2］第一次实现 了对丙 酮 丁 醇 梭 菌 ATCC 824 的 遗 传 改 造。2001 年，丙酮丁 醇 梭 菌 基 因 组 测 序 完 成［3］。 此 后，通 过 代谢工程改造丙酮丁醇梭菌生产丁醇取得了巨大 的进步。
Abstract： Butanol is an important bulk chemical with wide application． Butanol was considered as a new biofuel alternative． Due to the energy and environment crisis，bio-based butanol production from sustainable biomass has been paid attention worldwide． Metabolic engineering as an efficient tool has been used widely for biobutanol production with different microorganisms． Metabolic engineering classic acetone-butanol-ethanol（ ABE） fermentation was a significant direction for better butanol production． The rational design butanol producing pathway in model bacteria was another choice for butanol production． In this review，the progresses on metabolic engineering of butanol production in recent five years were summarized，the problems in butanol production to meet the demands of industrial production were also discussed． Key words： biobutanol； metabolic engineering； metabolic pathway； bio-manufacturing
醇提供了有力的工具。通过改造经典的丙酮丁醇发酵和定向改造模式微生物生产丁醇是生物丁醇研究的两个重
要方向。笔者从代谢工程改造的角度评述近 5 年来生物丁醇研究的进展，同时讨论了生物丁醇研究中需要着力解
决的问题。
关键词： 生物丁醇； 代谢工程； 代谢途径； 生物制造
中图分类号： Q78
文献标志码： A
文章编号： 1672 － 3678（ 2013） 02 － 0058 － 07
然而，与其 他 模 式 菌 株 相 比，丙 酮 丁 醇 梭 菌 缺 乏高效的遗传改造工具。同时，作为革兰氏阳性厌 氧菌，丙 酮 丁 醇 梭 菌 的 遗 传 操 作 更 加 复 杂。近 年 来，许多研究组在其他模式菌株中成功构建了来源 于丙酮丁醇梭菌的丁醇生产途径［4 － 9］，一些新的丁 醇生物合成途径也被设计出来［10 － 11］。笔者对代谢
James Liao 研究组首先实现了在大肠杆菌中生
图 2 大肠杆菌中优化的梭菌产丁醇途径 Fig． 2 Optimized clostridial butanol production
pathway in E． coli
产丁醇。丙 酮 丁 醇 梭 菌 产 丁 醇 途 径 中 的 hbd、crt、 bcd、etfAB 和 adhE2 基因在大肠杆菌中被成功表达， 同时表达大肠杆菌自身的硫解酶基因 atoB，打通了 丁醇生物合成通道。进一步敲除了大肠杆菌内部 的一些 竞 争 途 径 的 基 因，包 括： adhE、ldhA、frdBC、 fnr、pta。该 重 组 菌 株 在 M9 培 养 基 中 产 生 了 113 mg / L 的丁醇，在丰富培养基 TB 同时添加甘油的条 件下，该菌株可以生成 552 mg / L 的丁醇［4］。
2 利用大肠杆菌生产丁醇
大肠杆菌作为一种典型的模式菌株，其遗传背 景、遗传改造工具和遗传改造过程相比于丙酮丁醇梭 菌都更加清晰、更加丰富、更加容易。近些年来，利用 大肠杆菌生产丁醇取得了巨大的进步。不仅丁醇产 量和转化率达到了丙酮丁醇梭菌的水平，而且在代谢 途径优化和设计方面也获得许多成功，为微生物生产 丁醇提供了新的方向。以下从 3 种丁醇生成途径详 细介绍利用大肠杆菌生产丁醇的最新进展，大肠杆菌 中优化的梭菌产丁醇途径如图 2 所示。 2． 1 优化的梭菌途径
戴宗杰1，2 ，董红军2 ，朱 岩2 ，张延平2 ，李 寅2
（ 1． 中国科学技术大学 生命科学学院，合肥 230026； 2． 中国科学院 微生物研究所，北京 100101）
摘 要： 丁醇作为一种重要的大宗化学品具有广泛的用途，同时又是一种潜在的生物燃料。随着能源与环境危机
的日益加重，利用可再生原料通过微生物法生产丁醇受到全世界的普遍关注。代谢工程为定向改造微生物生产丁
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生物加工过程
第 11 卷
度为 13. 9 g / L。这种差异的原因还不清楚，可能是 由于基因插入失活的位点不同，导致蛋白酶活有差 异； 另外发酵条件的区别也可能是原因之一。生成 丁酸的第二个酶丁酸激酶也有类似的研究。当该 酶基因被插入失活后，丁醇的产量达到 15. 2 g / L，比 对照菌株的产量提高了 29% 。 ［13］
Βιβλιοθήκη Baidu
工程改造丙酮丁醇梭菌和其他模式微生物生产丁 醇进行总 结，比 较 了 不 同 微 生 物 生 产 丁 醇 的 问 题， 并展望了生物丁醇的未来发展方向。
1 利用丙酮丁醇梭菌生产丁醇
丙酮丁醇梭菌是生产丁醇的天然菌株，其丁醇代 谢途径已经得到了充分解析，如图 1 所示。通过糖酵 解产生的丙酮酸，在丙酮酸铁氧化还原蛋白的作用下 生成 CO2 和乙酰辅酶 A。2 个乙酰辅酶 A 分子通过硫 解酶聚合形成乙酰乙酰辅酶 A，乙酰乙酰辅酶 A 经过 还原、脱水、再还原三步催化之后生成丁酰辅酶 A，然 后在醇脱氢酶的作用下产生丁醇。这一丁醇生产途 径称为梭菌丁醇途径。丙酮丁醇梭菌在产生丁醇的 过程中也会产生一些副产物，主要包括乙酸、丁酸、乙 醇和丙酮，并且会释放出 H2 以及 CO2 。
图 1 经典的丙酮丁醇梭菌代谢途径 Fig． 1 Classical metabolic pathway of Clostridium acetobutylicum
随着丙酮丁醇梭菌遗传改造工具的发展，特别 是 II 型内含子技术在丙酮丁醇梭菌中的成功应用， 使得快速定向改造代谢支路成为可能。pta 基因和 ack 基因是生产乙酸的 2 个必须基因，其中 Pta 蛋白 将乙酰辅酶 A 转化为乙酰磷酸，然后通过乙酸激酶 （ Ack） 产生乙酸。Lehmann 等［12］的工作显示，pta 基 因突变体的丁醇生产能力没有明显变化； 而另外一 个研究组用 II 型内含子的方法插入失活了 pta 基 因，pta 基 因 突 变 体 的 丁 醇 生 产 能 力 却 提 高 了
第 11 卷第 2 期 2013 年 3 月
生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering
doi： 10． 3969 / j． issn． 1672 － 3678． 2013． 02． 009
Vol． 11 No． 2 Mar． 2013
生物丁醇代谢工程的研究进展
Metabolic engineering for biobutanol production： a review
DAI Zongjie1，2 ，DONG Hongjun2 ，ZHU Yan2 ，ZHANG Yanping2 ，LI Yin2
（ 1． School of Life Sciences，University of Science and Technology of China，Hefei 230026，China； 2． Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）
收稿日期： 2013 － 01 － 09 基金项目： 国家高技术研究发展计划（ 863 计划） （ 2011AA02A208） 作者简介： 戴宗杰（ 1986—） ，男，安徽六安人，博士研究生，研究方向： 丙酮丁醇梭菌代谢工程改造； 李 寅（ 联系人） ，研究员，E-mail： yli@ im． ac． cn
丙酮丁醇梭菌的另外一个代谢支路是产生丙 酮，该支路包括 2 个酶： 酰基转移酶和乙酰乙酸脱羧 酶，分别由 ctfAB 基因和 adc 基因编码。其中 ctfA 基 因突变体丧失了丙酮生成能力，其丁醇和乙醇的生 成能力相比对照菌株也下降很多； 而 adc 基因突变 体依然可 以 产 生 少 量 的 丙 酮，产 醇 表 现 则 类 似 于 ctfA 基因突变体［12］。这一结果和另外 2 个研究结 果类似［15，17］。ctfB 基 因 突 变 体 的 代 谢 表 型 类 似 于 ctfA 基因突变体［13］。之所以产丙酮途径被敲除后 产醇量降低，是因为丙酮生成途径和酸吸收是耦联 的，而酸吸收又与产醇相关联。
46%［13］。ack 基因突变体的丁醇产量提高了 16% ， 乙醇产量则提高了 63% ； ［14］ 另外一项研究也显示 了类似的结果［15］。
从丁酰辅酶 A 到丁酸也需要 2 个酶的催化，分 别是 ptb 基因编码的丁酰磷酸转移酶和 buk 基因编 码的丁酸激酶。ptb 基因突变体的乙醇产量达到 12 g / L，远远高于野生型菌株，而丁醇的产量下降到了 8 g / L［16］。但是 Jang 等［13］的工作显示，ptb 基因突 变体的乙醇产量只有 0. 9 g / L，而丁醇的最终质量浓
更高的能量 密 度，更 强 的 疏 水 性，同 时 不 具 有 腐 蚀 性，可以延 长 运 输 管 道 的 使 用 寿 命，可 以 直 接 使 用 而无需改造现有的动力引擎［1］。所以近年来，利用 生物法生产丁醇受到人们的普遍关注。
ABE（ acetone-butanol-ethanol） 发酵是生物法生 产丁醇的最主要方法，这一方法已经有近百年的历
化石能源的不断减少及环境问题的日益加重， 迫使人 们 寻 找 可 持 续 的 方 法 来 维 持 世 界 的 发 展。 利用可再生资源生产石油基化学品是一种重要的 可持续发展途径。丁醇作为一种大宗化学品，既是 生产许多化合物的重要原料，也是一种潜在的动力 燃料或者燃料添加剂。相对于燃料乙醇，丁醇具有
第2 期
戴宗杰等： 生物丁醇代谢工程的研究进展
59
史。工业上用来生产丁醇的菌株主要有丙酮丁醇梭 菌 （ Clostridium acetobutylicum ） 、拜 氏 梭 菌 （ C． beijerinckii、 C． saccharoperbutylacetonicum 和 C． saccharobutylicum） 等菌株，其中对丙酮丁醇梭菌的研 究最为深入。1992 年，Mermelstein 等［2］第一次实现 了对丙 酮 丁 醇 梭 菌 ATCC 824 的 遗 传 改 造。2001 年，丙酮丁 醇 梭 菌 基 因 组 测 序 完 成［3］。 此 后，通 过 代谢工程改造丙酮丁醇梭菌生产丁醇取得了巨大 的进步。
Abstract： Butanol is an important bulk chemical with wide application． Butanol was considered as a new biofuel alternative． Due to the energy and environment crisis，bio-based butanol production from sustainable biomass has been paid attention worldwide． Metabolic engineering as an efficient tool has been used widely for biobutanol production with different microorganisms． Metabolic engineering classic acetone-butanol-ethanol（ ABE） fermentation was a significant direction for better butanol production． The rational design butanol producing pathway in model bacteria was another choice for butanol production． In this review，the progresses on metabolic engineering of butanol production in recent five years were summarized，the problems in butanol production to meet the demands of industrial production were also discussed． Key words： biobutanol； metabolic engineering； metabolic pathway； bio-manufacturing
醇提供了有力的工具。通过改造经典的丙酮丁醇发酵和定向改造模式微生物生产丁醇是生物丁醇研究的两个重
要方向。笔者从代谢工程改造的角度评述近 5 年来生物丁醇研究的进展，同时讨论了生物丁醇研究中需要着力解
决的问题。
关键词： 生物丁醇； 代谢工程； 代谢途径； 生物制造
中图分类号： Q78
文献标志码： A
文章编号： 1672 － 3678（ 2013） 02 － 0058 － 07
然而，与其 他 模 式 菌 株 相 比，丙 酮 丁 醇 梭 菌 缺 乏高效的遗传改造工具。同时，作为革兰氏阳性厌 氧菌，丙 酮 丁 醇 梭 菌 的 遗 传 操 作 更 加 复 杂。近 年 来，许多研究组在其他模式菌株中成功构建了来源 于丙酮丁醇梭菌的丁醇生产途径［4 － 9］，一些新的丁 醇生物合成途径也被设计出来［10 － 11］。笔者对代谢
James Liao 研究组首先实现了在大肠杆菌中生
图 2 大肠杆菌中优化的梭菌产丁醇途径 Fig． 2 Optimized clostridial butanol production
pathway in E． coli
产丁醇。丙 酮 丁 醇 梭 菌 产 丁 醇 途 径 中 的 hbd、crt、 bcd、etfAB 和 adhE2 基因在大肠杆菌中被成功表达， 同时表达大肠杆菌自身的硫解酶基因 atoB，打通了 丁醇生物合成通道。进一步敲除了大肠杆菌内部 的一些 竞 争 途 径 的 基 因，包 括： adhE、ldhA、frdBC、 fnr、pta。该 重 组 菌 株 在 M9 培 养 基 中 产 生 了 113 mg / L 的丁醇，在丰富培养基 TB 同时添加甘油的条 件下，该菌株可以生成 552 mg / L 的丁醇［4］。
2 利用大肠杆菌生产丁醇
大肠杆菌作为一种典型的模式菌株，其遗传背 景、遗传改造工具和遗传改造过程相比于丙酮丁醇梭 菌都更加清晰、更加丰富、更加容易。近些年来，利用 大肠杆菌生产丁醇取得了巨大的进步。不仅丁醇产 量和转化率达到了丙酮丁醇梭菌的水平，而且在代谢 途径优化和设计方面也获得许多成功，为微生物生产 丁醇提供了新的方向。以下从 3 种丁醇生成途径详 细介绍利用大肠杆菌生产丁醇的最新进展，大肠杆菌 中优化的梭菌产丁醇途径如图 2 所示。 2． 1 优化的梭菌途径
戴宗杰1，2 ，董红军2 ，朱 岩2 ，张延平2 ，李 寅2
（ 1． 中国科学技术大学 生命科学学院，合肥 230026； 2． 中国科学院 微生物研究所，北京 100101）
摘 要： 丁醇作为一种重要的大宗化学品具有广泛的用途，同时又是一种潜在的生物燃料。随着能源与环境危机
的日益加重，利用可再生原料通过微生物法生产丁醇受到全世界的普遍关注。代谢工程为定向改造微生物生产丁
60
生物加工过程
第 11 卷
度为 13. 9 g / L。这种差异的原因还不清楚，可能是 由于基因插入失活的位点不同，导致蛋白酶活有差 异； 另外发酵条件的区别也可能是原因之一。生成 丁酸的第二个酶丁酸激酶也有类似的研究。当该 酶基因被插入失活后，丁醇的产量达到 15. 2 g / L，比 对照菌株的产量提高了 29% 。 ［13］
Βιβλιοθήκη Baidu
工程改造丙酮丁醇梭菌和其他模式微生物生产丁 醇进行总 结，比 较 了 不 同 微 生 物 生 产 丁 醇 的 问 题， 并展望了生物丁醇的未来发展方向。
1 利用丙酮丁醇梭菌生产丁醇
丙酮丁醇梭菌是生产丁醇的天然菌株，其丁醇代 谢途径已经得到了充分解析，如图 1 所示。通过糖酵 解产生的丙酮酸，在丙酮酸铁氧化还原蛋白的作用下 生成 CO2 和乙酰辅酶 A。2 个乙酰辅酶 A 分子通过硫 解酶聚合形成乙酰乙酰辅酶 A，乙酰乙酰辅酶 A 经过 还原、脱水、再还原三步催化之后生成丁酰辅酶 A，然 后在醇脱氢酶的作用下产生丁醇。这一丁醇生产途 径称为梭菌丁醇途径。丙酮丁醇梭菌在产生丁醇的 过程中也会产生一些副产物，主要包括乙酸、丁酸、乙 醇和丙酮，并且会释放出 H2 以及 CO2 。
图 1 经典的丙酮丁醇梭菌代谢途径 Fig． 1 Classical metabolic pathway of Clostridium acetobutylicum
随着丙酮丁醇梭菌遗传改造工具的发展，特别 是 II 型内含子技术在丙酮丁醇梭菌中的成功应用， 使得快速定向改造代谢支路成为可能。pta 基因和 ack 基因是生产乙酸的 2 个必须基因，其中 Pta 蛋白 将乙酰辅酶 A 转化为乙酰磷酸，然后通过乙酸激酶 （ Ack） 产生乙酸。Lehmann 等［12］的工作显示，pta 基 因突变体的丁醇生产能力没有明显变化； 而另外一 个研究组用 II 型内含子的方法插入失活了 pta 基 因，pta 基 因 突 变 体 的 丁 醇 生 产 能 力 却 提 高 了
第 11 卷第 2 期 2013 年 3 月
生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering
doi： 10． 3969 / j． issn． 1672 － 3678． 2013． 02． 009
Vol． 11 No． 2 Mar． 2013
生物丁醇代谢工程的研究进展
Metabolic engineering for biobutanol production： a review
DAI Zongjie1，2 ，DONG Hongjun2 ，ZHU Yan2 ，ZHANG Yanping2 ，LI Yin2
（ 1． School of Life Sciences，University of Science and Technology of China，Hefei 230026，China； 2． Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）
收稿日期： 2013 － 01 － 09 基金项目： 国家高技术研究发展计划（ 863 计划） （ 2011AA02A208） 作者简介： 戴宗杰（ 1986—） ，男，安徽六安人，博士研究生，研究方向： 丙酮丁醇梭菌代谢工程改造； 李 寅（ 联系人） ，研究员，E-mail： yli@ im． ac． cn
丙酮丁醇梭菌的另外一个代谢支路是产生丙 酮，该支路包括 2 个酶： 酰基转移酶和乙酰乙酸脱羧 酶，分别由 ctfAB 基因和 adc 基因编码。其中 ctfA 基 因突变体丧失了丙酮生成能力，其丁醇和乙醇的生 成能力相比对照菌株也下降很多； 而 adc 基因突变 体依然可 以 产 生 少 量 的 丙 酮，产 醇 表 现 则 类 似 于 ctfA 基因突变体［12］。这一结果和另外 2 个研究结 果类似［15，17］。ctfB 基 因 突 变 体 的 代 谢 表 型 类 似 于 ctfA 基因突变体［13］。之所以产丙酮途径被敲除后 产醇量降低，是因为丙酮生成途径和酸吸收是耦联 的，而酸吸收又与产醇相关联。
46%［13］。ack 基因突变体的丁醇产量提高了 16% ， 乙醇产量则提高了 63% ； ［14］ 另外一项研究也显示 了类似的结果［15］。
从丁酰辅酶 A 到丁酸也需要 2 个酶的催化，分 别是 ptb 基因编码的丁酰磷酸转移酶和 buk 基因编 码的丁酸激酶。ptb 基因突变体的乙醇产量达到 12 g / L，远远高于野生型菌株，而丁醇的产量下降到了 8 g / L［16］。但是 Jang 等［13］的工作显示，ptb 基因突 变体的乙醇产量只有 0. 9 g / L，而丁醇的最终质量浓