DNA合成原理

谢
谢
O O CPG
TCA
HO
O O CPG
B ase 1
DM T
CPG：Controlled pore glass，可控微孔玻璃珠，作为寡居核苷酸依附的 固体载体。
2. 耦连 （Coupling）
a. 活化 （Activation）
D M T O O O P B a s e 2 H N N N O P N D M T O O B a s e 2
各纯化方法的比较
纯化方法
C18柱脱盐
优 点 和 缺 点
省时省力，但只能去除盐分，不能去除比目的片段短的小片段。
OPC PAGE HPLC
省时省力，纯化效果略好于C18柱，但对于小片段的去除效果 不太好，并且吸附量低，对于长于25bp的片段纯化效果不好。
纯化效果较好，能去除小片段，与C18柱联用效果更好，缺点 是费时费力，样品损失大。 自动化程度高、省人力，可以去除小片段，纯化效果较好，缺 点是设备昂贵，纯化量小，通常不能纯化40bp以上的片段。
U 尿嘧啶 Uracil
H N H N N o g i l o O C 胞嘧啶
O N H N N N o l i g o H N H G 鸟嘌呤
O H N H N
N H N N N N o l i g o o g i l o O
T 胸腺嘧啶
A 腺嘌呤
寡聚核酸的用途
PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变 基因建构（全基因合成） 反义核酸
B a s e 2 O
O P NO C H C H C N 2 2 NN N
O C P G
O N C H C H C O P O 2 2
B a s e 1 O
O C P G
3. 加帽 （Capping）
O H O B a s e 1 A c e t i c A n h y d r i d e O O C P G O O O O C P G
脱氧核苷酸
核苷酸
Base=A, G, C,T
Base=A, G, C, U
N H 2 N N N N H A 腺嘌呤 Adenine
N
O N H
NH2 N N H O
O NH N H O
NNN H 2 H G 鸟嘌呤 Guanine O
NH N H O
C 胞嘧啶 Cytosine
T 胸腺嘧啶 Thymine
多聚酶链式反应
寡核苷酸的化学合成原理
目前，oligo DNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚 磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱 保护、耦连、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去， 最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比 较稳定的优点。
O B a s e 1 O
耦连中未反应核苷酸链
已加帽核苷酸链
4. 氧化 （oxidation）
D M T O
B a s e 2 O
D M T O
B a s e 2 O
O O N C H C H C O P 2 2
I 2
B a s e 1 O
O O N C H C H C O P B a s e 1 2 2 O O O C P G
该方法的特点： • 第一个核苷酸是3’固定在固相载体上 • 每一个核苷酸依次连接上去 • DNA合成的方向是3’→5’ • 合成是在疏水环境中进行
OCH3 HN N H 3C O O O O P N N
O
O C H 3
O H N
N
H C O 3 O N O O O P O N
O
N
CN
C N
dA-phosphoramidite
dT-phosphoramidite
O
OCH3 O N H3CO O O O P N N
OCH3 N
NH O N H
HN
H 3C O
O
O O O P
N
O
N
O
N
CN
CN
dG-phosphoramidite
dC-phosphoramidite
1. 脱DMT （Detritylation）
DM T O Base 1
HPLC 纯化
HPLC根据吸附介质分为反相柱和离子柱。 反相柱是根据疏水性的差别来分离的，即疏水性更 强的长片段比短片段吸附能力更强，后出峰； 离子柱上根据不同长度寡核苷酸带有不同净电荷， 较长的片段带有高电荷比带有电荷低的短片段在离子柱 内流动得慢，从而依次将不同片段洗脱出来。 优点：自动化程度高，省人力，纯化效果好，纯度可达 99%以上，特别是在标记引物和特殊修饰探针纯 化中效果好。 缺点：纯化量小，不能纯化长片段，设备昂贵。
纯
C18柱脱盐纯化 OPC 纯化 PAGE 纯化
化
HPLC 纯化
C18柱脱盐纯化
C18柱上一种活性炭柱子，又称为简易反相柱，它对DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱， 所以能有效地去除盐分。 优点：所有纯化方法中最简单的一种。
缺点：不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成 效果很好时才能选用此法。
iP r 2 N
O C H 2C H 2C N
iP r 2 N H
O C H 2C H 2C N
源自文库
N N D M T O O O P N B a s e 2 N
N
N N N
O C H 2C H 2C N
b. 耦连 （Coupling）
D M T O D M T O B a s e 2 O H O B a s e 1 O
优点：方便、快捷。 缺点：其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带 入的可能，而且负载量小，特别是对长于25个碱基 以上的片段纯化效果不好。
PAGE 纯化
聚丙烯酰胺凝胶电泳法，利用不同长度片段DNA在凝胶 中迁移率不同来分离大小片段。由于各分子所带电荷和 大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁 移速度慢，待目的片段与缺碱基片段分开后，经过剥离 凝胶，切割目的片段，浸泡碎胶，再从泡胶的盐溶液中 回收目的DNA。 优点：纯化效果好，尤其是纯化长链效果好。 缺点：费时费力，样品损失大。
磷酸
核苷酸
核苷
戊糖：核糖 碱基：A 、G 、C 、U
核 酸
脱氧核苷酸
磷酸
戊糖：脱氧核糖
脱氧核 苷
碱基：A 、G 、C 、T A （腺嘌呤）、G （鸟嘌呤）、C （胞嘧啶）、 U （尿嘧啶）、T （胸腺嘧啶）
H O
O
B a s e
B a s e H O O
O O P O H O H
O O H O P O H O H
PCR：Polymerase Chain Reaction
PCR是由美国科学家穆利斯(Kary Mullis)提出的一种体 外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法， 此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚 合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直 至完成新的DNA合成。 基本反应步骤 ：高温变性 → 低温退火 → 适温延伸。
寡聚核苷酸
背景介绍
寡核苷酸的化学结构
寡核苷酸的用途
寡核苷酸的化学合成原理
寡核苷酸的纯化方法
DNA的化学结构
双连螺旋结构
1953年，沃森和克里克 发现了DNA双螺旋的结 构，开启了分子生物学 时代，使遗传的研究深 入到分子层次，“生命 之谜”被打开，人们清 楚地了解遗传信息的构 成和传递的途径
OPC 纯化
利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂， 合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT，所有合 成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有 DMT片段的吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片 段吸附能力弱从而被洗脱，然后用酸脱去吸附在OPC柱上 DNA的DMT，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。
O C P G
核苷酸的纯化方法
在所有合成循环结束后，就得到一个目标DNA片段粗品， 首先需经过氨解步骤，然后再通过各种方式进行纯化。
氨
切
解
割：将合成好的寡聚核苷酸从固体载体（CPG）上化学切割下来。 常用新鲜的浓氨水来裂解CPG 上连接化合物与初始核苷间的 酯键。 脱保护基：将合成好的寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉。 一般用新鲜的浓氨水来处理较长时间以脱掉氰乙基（P）、苯 甲酰基（ dA、dC）、异丁酰基 （dG）。