核酸提取常见试剂的作用原理

异硫氰酸胍

强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐就是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的就是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子与阳离子基团,它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如SDS存在的情况下,可以破坏疏水作用。

盐酸胍、尿素

盐酸胍就是一个核酸酶的强抑制剂,它并不就是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。

4-8M可断裂氢键,有两种可能机制:1变性蛋白与盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展与溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往就是不可逆的。

高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性

十二烷基肌氨酸钠

使蛋白质解体变性

巯基试剂

1防止蛋白质或酶等(如辅酶A)分子中SH基团氧化成二硫键,2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT,DDTE、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于她就是生物体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于2%。

巯基乙醇

β-巯基乙醇的主要作用就是破坏RNase蛋白质中的二硫键(肽与蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键)。

1 还原蛋白质二硫键,使Rna酶变性

2 抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA与DNA的交联

3 保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要

巯基乙醇还原二硫键,使RNA酶失活

化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键与二硫键,不能使蛋白质彻底变性

加上还原剂巯基乙醇或DTT,能还原二硫键,使RNA彻底变性

DTT二硫苏糖醇

刺激性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时,两者效果相近,但DTT价格略高一些。由于容易被空气氧化,因此DTT的稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低,随着pH值的降低,DTT的有效还原性也随之降低;DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

抑制Rnase活性

TCEP 三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐

半胱氨酸

Trizol

苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等。TRIzol的主要成分就是苯酚。苯酚的主要作用就是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源与外源RNase(RNA酶)。

0、1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。

异硫氰酸胍属于解偶剂,就是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。

β-巯基乙醇的主要作用就是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

液氮

组织破碎,裂解细胞

SDS

十二烷基硫酸钠

阴离子去垢剂,高温(55-65℃)裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,形成SDS/蛋白质/多糖复合物,释放核酸,提高盐(KAc或NaAc)浓度并降低温度(冰浴),使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的DNA

操作简单,温与,可提取到高分子量的DNA,但产物多糖类杂质较多

阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶K与抗氧化剂、螯合剂一起使用

可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离

溶解膜类蛋白

SDS 能裂解细胞。使细胞中的蛋白质与核酸之间常借着静电引力或配位键结合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使染色体离析,蛋白变性,释放核酸。

(1)SDS就是一种阴离子表面活性剂,能使蛋白质的氢键与疏水键打开,并结合到蛋白质的疏水部位;

(2)SDS可引起蛋白质构象改变

(3)SDS就是一种良好的解离剂,可使蛋白质溶解,变性

(4)形成SDS-蛋白质复合物,并使复合物带负电

质粒方面:在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl,您会发现SDS在高盐浓度下就是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果您加入的不就是NaCl而就是KCl,您会发现沉淀的量要多的多。这其实就是十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS就是水不溶的,因此发生了沉淀。如此瞧来,溶液III加入后的沉淀实际上就是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的就是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。基因组DNA一旦发生断裂,只要就是50－100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了

CTAB

CTAB:十六烷基三甲基溴乙胺,低温时易沉淀

阳离子去污剂

一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物,低盐浓度下可沉淀的表面活性剂

就是一种阳离子去污剂, 低离子强度(0、1-0、5M NaCl),沉淀核酸与酸性多聚糖,而蛋白质与中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度的溶液中(>0、7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质与多聚糖形成复合物,只就是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的DNA,这种去污剂加入调节至高离子强度的细菌与细胞裂解液中(＞0、7M NaCl),经过连续的酚/氯仿抽提,去除CTAB/黏多糖/ 蛋白质复合体,异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将DNA分离出来

CTAB还有提高DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作用

CTAB法的主要特点就是用用较广

CTAB溶液在低于15度会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料时,必须预热,且离心温度不低于15度

EDTA

酶抑制剂,螯合二价金属,抑制金属依赖性的酶

螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制细胞中DNase的活性,该酶可降解DNA

EDTA就是去垢剂,结合离子用,而它结合的部分离子就是能够诱发或者促进RNA酶活性的,比如Ca2+。EDTA就是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+与Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性就是需要依赖二价阳离子的,所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性碱性条件下才能够溶解,要与NaOH粉末混合后,再加水,然后用NaOH水溶液调节pH。

0、01M,DNase酶基本失活。

BSA

酶抑制剂,使一些降解酶的活性的表面变性

精胺或其她多胺

酶抑制剂,降低核酸酶的影响

氰化物

酶抑制剂,降低重金属氧化酶的影响

PVP

减少酚类、醌类、单宁类物质的影响,抗氧化作用,络合多酚与萜类物质,防止多酚类褐变而氧化,去除多糖与色素,色素就是PCR强抑制剂,必须去除

样品液氮研磨及提取缓冲液中加入PVP或PVPP等能络合多酚与萜类物质,离心或氯仿抽提出去,有效防止多酚氧化成醌类,避免溶液变褐色而具有抗氧化能力

提取液中加入适量的PVP或PVPP能提高DNA的纯度,用量根据杂质而定(1-6%),PVP同时能去除多糖,因此将PVP与巯基乙醇配合使用并调整用量,能有效防止多酚污染

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)就是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能与多糖结合,有效去除多糖。

Triton-x100

Triton X100之类的去垢剂有苯环结构,所以在280nm有很强的吸收。

蛋白酶K

蛋白酶K:切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,切割脂族与芳香族氨基酸的羧基端肽键,将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。