第四章 目的基因的转化及其原理

⑥决定寄主菌株的植物寄主范围。 ⑦有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌 体的“排外性”。
12
表4-1 Ti质粒放入部分基因及其功能
基因缩写 表型及功能 在基因图上的位置（kb） pTiC58 （211kb）
age 排斥噬菌体API 111-113
pTiAch5（195kb）
6
二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
• 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能 • 2、T-DNA的基因结构与功能
• 3、Vir区操纵子的基因结构与功能
7
一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能
• 1. Ti质粒的遗传特性及类型 • Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合 的环状DNA分子。
22
三、农杆菌Ti质粒基因转化机理
• 已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。 T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转 入植物细胞，并非整个 Ti质粒都进入植物细胞。该 基因转化过程是一个复杂的遗传工程。
23
1、T-DNA的加工及转移
24
四、T链整合植物基因组的分子机理
• 1、整合位点及其特性
2.8 1.0 1.5 4.5 2.2 9.5 1.0
1 1 2 4 2 11 1
组成型 组成型 诱导型 诱导型 诱导型 诱导型 诱导型
帮助接受植物信号分子启动毒性区表达 转录活化 T-DNA加工 T-DNA加工 T-DNA加工 膜转运蛋白 T-DNA转运
wk.baidu.com
virH
94.2
2
诱导型
细胞色素P-450单氧化酶
H A B G C D E F
章鱼碱
胭脂碱
tzs A B G C D E
图 4-5 章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的Vir区编码基因结构
21
表 4-4 章鱼碱型Ti质粒vir基因基本结构与功能
遗传座位 分子量（kb） 基因数 表达方式 功能
virA virG virC virD virE virB virF
18
TL
iaaH iaaM ipt
TC
TR
aux
cyt
ocs
frs
mas
ags
图4-3 章鱼碱型Ti质粒的T-DNA编码基因结构 iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸单加氧酶； aux：生长素；ipt: 异戊烯基转移酶； cyt：细胞分裂素；frs：琥珀碱合成酶； mas：甘露碱合成酶；ags：农杆碱合成酶
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒 可以被分成四种类型：
• • • •
章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型（agropine） 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)
8
图3-1 章鱼碱型Ti质粒基因图。
• (1)
pSC101
Stanley Cohen(人名) plasmid
pTiT37/pAtT37
根癌农杆菌的质粒类型 （Agrobacterium tumefaciens）
pRiT37/pArT37
发根农杆菌的质粒类型 （Agrobacterium rhizogenes）
4
（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示， • 如：leu （亮氨酸基因位点） 基因表现型用正体表示，如Leu （3）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后 加该位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分别 为突变型或缺陷型，表示为：leuA、leuB
14
图3-2 Ti质粒上几个重要区域及其序列 LB：左边界序列； RB：右边界序列
15
2. T-DNA的结构特点
• l Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb；
• l T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；
• l 在T-DNA的5´端和3´端都有真核表达信号。如 TATAbox、AATAAbox及polyA等。
10-12
agr
arc agc noc nos occ ocs
对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感
分解精氨酸 分解农杆菌 分解胭脂碱 合成胭脂碱 分解章鱼碱 合成章鱼碱
138-141
4-5 — 18-20 0-1 — —
—
9-10 54-57 — — 39-41 0-1
ori
roi（tmr） shi（tms） tra inc
16
• T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序 列（border sequence），分别称之为左边界（BL或TL） 和右边界（BR或TR）。 • 该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更 为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心 部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。
•T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何 一条染色体 •插入位点常有以下特点： •①T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点； •②T-DNA与植物DNA连接处富含A，T碱基对； •③植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度 的同源性。
25
2. T-DNA的整合机理 • 双链断裂修复模型（DSBR model） • 单链缺口修复模型（SSGR model）
(4)抗性和敏感性分别用R或r，S或s表示
5
2、植物基因工程载体的种类及特性
克隆载体 中间克隆载体
中间黏粒载体 质粒/黏粒载体 基因标记载体
植物基因 工程载体
中间载体 中间表达载体 卸甲载体 onconc+ 一元转化载体 （顺式载体） 双元转化载体 （反式式载体）
共整合载体
转化载体
SEV（拼接末端载体； split-end vector）
10
（3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转 移，因此称之为接合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
11
3. Ti质粒的生物学功能
•Ti质粒的功能可归为以下7个方面:
①参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。
②诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。
③赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。
④赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。
⑤为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。
26
• Sci，IF：9.205
27
28
Fig 4-6 Illegitimate recombination models for T-DNA integration. (a) Double-strand breakrepair (DSBR) and single-strand gap-repair (SSGR) models equally explain the integration events leading to T-DNA insertion 621-x34. As outlined in the Discussion, the DSBR model predicts a double-strand break in the target. Unwound or exonuclease processed ends of the TDNA and of the target anneal by partial homologous pairing. Single-strand overhangs are removed by endo- or exonuclease digestion; the ends are repaired and ligated. The SSGR model predicts a nick in the target that is converted to a gap by a 5'-3' exonuclease. The T-strand invades the gap and a synapsis is formed by partial pairing between T-DNA ends and target. The overhangs of the T-DNA are removed and the T-strand is ligated to the target. A nick introduced into the second strand of the target initiates repair synthesis of the second strand of the T-DNA. (b) Application of the SSGR model for T-DNA insertion 621-36. As proposed in the model of insertion 621-x34, repair at the ends of invading T-strand may occur before ligation. Absence of an internal CAGT T-DNA sequence from the right junction of insert 621-36 suggests that copying of the target plant DNA led to alteration of the right T-DNA end during integration. Mismatch repair may similarly explain the observed deletion. (c) A modified version of SSGR model explaining possible involvement of VirD2 protein in recombination events that resulted in T-DNA insertions 621-37 and N6H-cs4. T-DNA invasion depicted in the model involves VirD2-mediated recognition of a nick (or gap) that is followed by ligation of the 5' end of the Tstrand to the target DNA. The 3' end of the T-strand moves along the target, while the unwound target DNA strand is removed by exonucleolytic digestion. At the position where the 3' end of the T-strand is stabilized by base-pairing, the T-strand is ligated to the target. At the same position a nick is introduced in the second strand of the target that defines the left break-point of target deletion and initiates the replication of the T-strand. Symbols used for presentation of putative recombination events are explained underneath the models.
• 致瘤性：右边界作用大于左边界
17
3. T-DNA上的编码基因及功能
• T-DNA的转录有下述共同点： ①T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录。 ②T-DNA上每个基因都有各自的启动子。 ③基因的转录由植物细胞RNA聚合酶Ⅱ完成。 ④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号， T-DNA的转录机理可能与真核生物相同。 ⑤植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。
1
第四章 目的基因的转化及其原理
第一节 植物基因工程载体及其构建
2
植物基因转化系统
• 载体转化系统（Ti质粒转化载体，Ri质粒转化载 体） • 原生质体DNA直接导入转化系统 • 基因枪DNA导入转化系统
• 花粉粒介导转化系统
3
一、植物基因工程载体命名规则及种类
• 1、植物基因工程载体命名规则：
复制起点
抑制长根 抑制长芽 Ti质粒转移 质粒不相容性
33-35
206-207 202-203 121-123 33-35
90-95
190-192 187-188 21-30 90-95
13
二、T-DNA的基因结构与功能
• 1.T-DNA的发现 Chilton 等 人 于 1982 发 现 。 (MD CHILTON, D TEPFER, A PETIT, D CHANTAL , CD FRANCINE, T JACQUES. Agrobacterium rhizogenes inserts TDNA into the genomes of the host plant root cells. Nature,1982(295):432 - 434 ） 研究证明，这部分 DNA 是从质粒 DNA 上切割后， 转移到肿瘤细胞，故称之为转移 DNA （ transferredDNA）。
19
T-DNA区基因的功能
• 第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因， 如:frs、mas、ags • 第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分 裂素基因cyt •
20
三、Vir区操纵子的基因结构与功能
• • • • 1、 Vir区操纵子的基因结构： 农杆菌致瘤所必须的 ； Vir区仅位于T区DNA左侧； 两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。
章鱼碱基因 毒力区 T-DNA区 细胞分裂素基因 结合转移区 生长素基因 冠瘿碱代谢 冠瘿碱合成 复制起始区
9
2. Ti质粒的功能区域
• Ti质粒可分为四个区：
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转 移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上 的基因与肿瘤的形成有关。 （2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活 T-DNA 转移，使农杆菌表现出毒 性，故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相 邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。