HBV DNA荧光定量PCR技术

一、HBV DNA荧光定量PCR技术

（一）标本

血清、血浆（其它如组织细胞、乳汁、精子、尿液等体液）；标本应封闭保存，特别在夏季，如果标本暴露的过久，开盖保存，很容易出现水分蒸发，检测结果和上一次的检测结果会有较大的差异。环境条件影响不大，比如保存在 -8°、 -20°、 24°、还是室温，对高中低病毒含量的最后的检测结果影响不是太大，只要封闭保存就可以。因此可常温运输，但不可泄露。

（二）检测方法

国内最常使用 PEG （聚乙二醇方法）法进行核酸提取，采用 TaqMan 探针进行荧光PCR 扩增。扩增 40 循环进行结果分析，如下图一所示：典型的双 S 形的曲线图，越早出现荧光曲线的病毒含量越高，越晚越低。根据不同的梯度的四个标准品进行定量。如果血清或标本里面没有病毒，就是一个阴性直线。最近我们在彻底解决污染问题之后采用扩增 50 个循环的方法。优点是让扩增管里的反应液充分反应，缺点是如果实验室存在一个潜在的污染或操作人员操作习惯不好，很容易出现携带污染，造成假阳性。对实验室的来说不应该通过减少扩增的循环数来解决污染问题，而应该通过科学的管理，提高试剂的质量，以及养成一个良好的操作习惯，或防污染的习惯来解决假阳性的问题。增加循环数有利于标本检测结果的判断，这将来可能是实验室发展的一个趋向。 COBAS TaqMan 技术在我们国家已经有好多实验室有这种全自动的核酸提取扩增系统，它的优势重点在于检测病毒含量比较低的血清标本，但是对于病毒含量比较高的，往往出现荧光 PCR 竞争的缺点。

图一为： PCR 扩增曲线

（三）污染的预防与排除

PCR 扩增产物污染是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题，所以扩增区的仪器如枪头等要注意。最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝 , 因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。标本处理区，包括扩增摸板的制备； PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR 扩增→产物分析→产物处理。切记 : 产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

（四）常用仪器

常用的 PCR 仪器： ABI 系列、罗氏系列、安捷伦系列、国产 SLAN 等。

（五）临床意义

检测血清或血浆 HBV DNA 阳性有什么临床意义？

1. 判断血清中是否有 HBV DNA 的存在

我们检测到的 HBV DNA 包括完整 HBV 病毒和 DNA 片段。目前我们用的 HBV DNA 荧光 PCR 法，还不能区分是完整病毒还是片段。只要检测到的病毒载量在检测线以上就可以定为标本含有 HBV DNA 。

2. 判断抗病毒疗效的评估指标

细胞内 HBV DNA 和 HBV DNA 确认方法。病人采用各种抗病毒药物，比如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦或替米夫定等抗病毒药物，因为这些药可以有效的抑制病毒复制，用药之前或用药之后，病人的血清里或外周血白细胞里是不是还有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反弹？这是临床医生关心的问题。随着抗病毒药物用药时间的延长，有些病人血清里面的 HBV DNA 一直处于检测线以下。因此目前临床医生有一些新的需求，就是能不能确认病人血清里究竟有没有 HBV DNA 。不同的实验室报告检测低限值不一样，有的实验室报 <1000 IU ，有的实验室报 <100 IU ， COBAS TaqMan<12 个， <12 个还是有病毒，血清里究竟有多少个？是临床急需的一种 HBV DNA 确认方法。即确认血清里面究竟有没有病毒。现在已经提出一种检测方法。

3.HBV DNA 阳性与传染性

感染乙肝病毒必须达到一定的量，突破各种屏障（血液里的补体、细胞因子、抗体等），进入肝细胞复制，才能达到传染性的要求，因此并不是接触到病毒都会被感染。HBeAg 的产生与意义→ HBeAg 与 HBV DNA 清除的不平衡带来的异常模式→ HBsAg 的包裹与剪切（完整 HBV 形成）→不同形式 HBsAg 的产生与意义。抗 HBc 、抗 HBe 和抗 HBs 的产生。四， HBV DNA 定量与乙肝血清学模式不同组合的意义。大三阳（表面抗原、 E 抗原和核心抗体阳性）并抗 HBs 阳性： HBsAg/IgM 。 E 抗原阳性说明病人体内的乙肝病毒处于一种活跃性的复制状态。这时有的病人合并表面抗体的阳性，是不是获得一定的抵抗力？不是。表面抗体往往是病毒复制时诱发了机体免疫答应而产生相应的抗体，这个抗体是针对表面抗原的 IgM 大蛋白抗体。因此它是机体对乙肝病毒复制免疫反抗的结果。这时要提高病人或保持病人的免疫功能；小三阳并抗 HBs 阳性：病毒活动性复制、不同型病毒的感染等；抗 HBs 或抗 HBc 与 HBV DNA 同时阳性：细胞内 HBV 的释放。

4. 血清游离和细胞内 HBV 检测与抗病毒治疗的关系

乙肝病人体内的病毒分成两个病毒状态，一个是游离的病毒，一个是细胞内的病毒，包括肝细胞和血细胞。游离的病毒意味着要被清除掉的病毒，除了个别的病毒再进入肝细胞，进行感染肝细胞。而细胞内的病毒与抗病毒治疗的效果更有直接的关系，如果要彻底清除乙肝病毒，最终检测肝脏细胞里病毒是阴性。但是肝穿只能局限于肝穿的组织，不能代表整个

肝脏。近几年对外周血 HBV DNA 的研究越来越多，外周血 HBV DNA 先消失，然后肝细胞游离的 DNA 再消失。即通过检测外周血 HBV DNA 来间接反应肝脏细胞里 DNA 是不是存在。虽然不能相互代替，但比血浆里面的 DNA 更进了一步。重性肝炎发生胆酶分离，检测不到血清里的病毒，但是外周血里面的 HBV DNA 反而和胆酶分离之前的水平一致。有的临床研究数据报道，如果外周血里的 HBV DNA 逐渐下降或消失，病人基本上得以康复。外周血 HBV DNA 的检测对重性肝炎患者的预后判断有重要的意义。

5. 血清 cccDNA 与肝脏组织内 cccDNA 的不同意义

最早的观点认为 cccDNA 是双价闭环环状 DNA ，它只在肝细胞里存在。后来越来越多的研究者发现，血清里不但有 cccDNA ，而且也有肝组织内的 cccDNA 。因为血清里的cccDNA 是从坏死的肝细胞释放出来的，并且它是环状的，不易被蛋白结合，也不易被消化，因此与肝组织内的 HBV DNA 有着不同的意义。目前认为血清里的 cccDNA 存在是病毒启动复制的标志，即病毒正处在复制的上升期，而肝组织内的 cccDNA 是病毒慢性化的标志。如果判断抗病毒药物效果，检测血清里的 cccDNA 没有太多的意义，而肝组织内的 cccDNA 反而有意义。即如果外周血 HBV DNA 已经转移到检测线以下，判断病毒是不是彻底清除？我们要检测肝组织内的 cccDNA 。血清 cccDNA 阳性代表病毒复制处在上升期。

（六）生物暴露与措施

1. 无损伤暴露

部位的清洗方法不同，如果血清溅到衣服上，通过有效的消毒液进行浸泡、清洗，一般浸泡的时间不能低于半个小时；如果溅到皮肤上，直接用洗涤液来洗，不要用力搓，要轻搓，然后用流水冲掉；如果溅到眼睛上，最忌讳的是用力来揉搓眼睛，用清水冲洗，一般病毒很难通过皮肤黏膜。也要对溅到你眼睛的血浆里做一个鉴定，看看它是不是含有病毒，病毒含量高低。

2. 创伤暴露

确定污染源 HBV 含量状态，如果高于 104以上，感染的可能性很大，如果低于 104以下，感染的可能性非常小。要在最短时间内要注射有效的高效价免疫球蛋白。

3. 特殊人群的讨论