第十五章 病毒病的分子生物学诊断

第十五章病毒病的分子生物学诊断

第一节概述

由于分子生物学技术的飞速发展，病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测，进入到可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平，包括对病毒核酸（DNA或RNA）和蛋白质分子的特异序列或结构。常用于病毒核酸序列和基因结构测定的分子生物学技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR）等，其中核酸杂交和PCR技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒病诊断最具应用价值的方法。DNA杂交的敏感度已经提高到0.05 pg /μl水平，只要有1000个DNA拷贝就可被检测出来；PCR可以检测出一个拷贝的DNA分子。

分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。获取病毒特异DNA片段的基础是进行病毒基因的克隆，即首先建立易于获得足够量病毒DNA的病毒基因无性繁殖系。病毒基因克隆以后，就可以比较容易地用酶促法或化学法来测定其核苷酸序列，再将获得的序列输入计算机，与基因序列库中的已知序列进行比较分析，就能准确地定位病毒特异的基因序列。到目前为止，越来越多的病毒基因被克隆和测序，几乎涉及所有动物病毒科的成员，一些重要病毒的全基因序列已被测定，这无疑促进了病毒病分子生物学技术的发展。

第二节病毒基因的克隆与鉴定

一、概述

病毒基因的克隆是在原核细胞中进行的，可以采用细菌质粒、粘性质粒或λ噬菌体作为载体，但最常用细菌质粒载体，在大肠杆菌中进行。

1．克隆用质粒的结构特征：必须具备3个主要结构特征。①具有负责其在宿主细胞中自主复制的复制起始区（Ori）；②具有克隆后便于筛选的标记基因（如对各种抗生素的抗性基因等）；③含有外源基因的克隆位点。常用的质粒有pUC18/ pUC19和pBR322等。pUC18/ pUC19为高拷贝质粒（700~800个/细胞），含有多克隆位点，以满足多种内切酶切割的DNA片段的克隆；pBR322为中拷贝质粒（50~80个/细胞）。

2．病毒基因克隆的目的：①病毒基因片段的大量制备；②序列分析；③基因表达与调控研究；④构建病毒载体；⑤制备核酸探针等。

3．病毒基因克隆方法：由于病毒基因组DNA和RNA以及单链和双链之别，可采用不同的基因克隆方法。DNA病毒基因可在限制性内切酶切割后直接进行克隆；RNA病毒

基因则必须先在试管内反转录成cDNA后再行克隆；反转录病毒基因可从感染细胞中提取前病毒DNA，随后再行克隆。总之，病毒基因的克隆包括以下几种类型：（1）单链DNA病毒的基因克隆主要指细小病毒科成员。这类病毒的基因组为单链线状DNA，两端因回文序列而形成发卡结构，这一结构是病毒基因组复制的引物。因此在感染过程中，病毒基因组可在宿主细胞内形成双链形式的中间复制型DNA。提取这种复制型DNA，用单链核酸酶去除两端的发卡结构，就可对该病毒全基因组进行克隆；也可用适当的内切酶切割后，回收所需的片段进行克隆。

（2）双链DNA病毒的基因克隆双链DNA病毒的基因组间差别较大。较小的双链DNA病毒，如SV40、乙型肝炎病毒等，基因组为环状，克隆时用只有单一切点的内切酶切割，然后与适当的载体连接，就可以建立全病毒基因组的无性繁殖系；较大的DNA病毒，如痘病毒科和疱疹病毒科的成员，克隆它们的全基因组十分困难，必须先用适当的内切酶将基因组切成较小的片段，然后再建立各片段的无性繁殖系，即建立基因组文库。或者根据研究目的，进行目的片段的克隆。这类病毒DNA均为线状双链，在克隆2个末端片段时，必须对该基因片段末端进行修饰，如补平或加接头，然后再行连接克隆。

（3）RNA病毒的基因克隆对分节段的RNA病毒，如流感病毒、轮状病毒、呼肠孤病毒等基因组，可先分离特定的RNA片段，反转录成cDNA后，加G/C尾或A/T尾与适当的载体连接。对不分节段的RNA病毒基因组，也可分段反转录成cDNA后，进行克隆。

（4）病毒基因组中某一特定基因片段的克隆如已了解这一病毒基因组的酶切图谱，则可选用适当的限制性内切酶切割病毒基因组，回收特定片段，重组到适当的质粒载体，进行克隆；如已知需要克隆的基因片段的序列，便可设计并化学合成1对特异引物，用PCR 法扩增这一片段，然后重组到适当的质粒载体进行克隆。

二、基因克隆与鉴定方法

虽然病毒种类和实验目的不同，基因克隆的方法也不尽相同，但任何一种病毒基因克隆方法均有3个主要步骤：①病毒基因组的提取；②与质粒载体的连接重组；③重组质粒的筛选、鉴定。

（一）病毒基因组的提取

基因组提取的基本原则是，先从感染组织或细胞、以及含病毒的分泌物和排泄物中提取病毒粒子，再除去病毒蛋白、提取病毒核酸。在提取过程中，要注意避免核酸酶对病毒核酸的降解作用。特别在提取RNA时，所用的试剂和用品均需要事先进行无Rnase处理或高压灭菌。此外在提取较大分子量的病毒DNA时，要彻底去除病毒蛋白（通常使用蛋白酶K）和避免剧烈振荡（否则核酸链断裂）。

1．从纯化病毒子提取核酸：一般方法如下。

（１）取适量纯化的病毒粒子；

（２）加入蛋白酶K至终浓度500 g/ ml、SDS至终浓度1 %，37℃水浴30 min；

（３）加入等体积酚/氯仿抽提1次，再用氯仿抽提1次；

（４）于水相中加1/10体积2.5 mol/L KAC或5 mol/L NaCl，再加2.5倍体积无水乙醇，置―20℃至少2 h或―80℃（或液氮气相）15 min；

（５）在4℃下，15 000r/min离心15 min，小心吸取上清；

（６）70 %冷乙醇洗涤沉淀，真空抽干，或置37℃干燥，最后根据需要加适量无菌去离子水或TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）溶解核酸沉淀，―20℃保存备用。

这样提取的核酸纯度较高，DNA可直接用于酶切和克隆，RNA可直接进行常规反转录合成cDNA，或者应用RT-PCR扩增所需基因片段。

2．病毒感染细胞总RNA的提取：PCR不要求十分纯净的病毒核酸，可直接用聚乙二醇（PEG）浓缩的病毒提取核酸样品。对不易纯化的病毒进行基因克隆时，可在病毒粒子装配之前，病毒核酸复制达高峰时，直接提取感染细胞的核酸，用PCR方法扩增所需的基因并克隆。现以猪瘟病毒为例介绍。

（1）创造一个无RNA酶（RNase）的环境RNase无处不在，很难灭活，RNA在提取过程中极易被其污染而降解。因此，为提取完整的RNA必须创造一个无RNase 的环境。须作到以下几点：

①必须采用灭菌的一次性塑料制品，不得重复使用。若塑料制品无Rnase污染，不需预先进行Rnase灭活处理。

②非一次性玻璃和塑料用品须在使用前适当处理，以确保无Rnase。玻璃器皿应于250℃干考4 h，塑料制品应用0.05 %焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡过夜，然后高压灭菌。

③所有溶液（Tris除外）均须加入0.05 %的DEPC，室温处理过夜，然后高压灭菌，去除DEPC。

④整个操作过程应戴一次性手套。

（2）感染细胞总RNA的提取

①单层细胞在接种病毒48 h后，倾弃培养液，用灭菌的PBS（0.01 mol/L，pH7.4）将细胞单层洗2遍。

②按每108个细胞加8 ml变性溶液于感染细胞单层上，轻微摇动，直至细胞裂解脱落，此时，溶液变粘稠。变性溶液的成分为4 mol/L异硫氰酸胍，25 mol/L柠檬酸钠（pH7.0），

0.5 %十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl），0.1 mmol/L -巯基乙醇。

③用吸管将此裂解液转移至50 ml锥形灭菌离心管中。

④加入1/10体积的2 mol/L NaAc(pH 4.0)于上述细胞裂解液中，颠倒并充分混匀。

⑤加等量水饱和酚: 氯仿: 异戊醇（50 : 49 : 1）混合物，颠倒混合，轻轻摇荡10 s，冰浴15 min。

⑥4℃下，8 000r/min离心20 min。

⑦小心吸取含RNA的上层水相至另一新的50 ml离心管中。

⑧加等量异丙醇，置―20℃过夜，或液氮气相（或）15 min。

⑨4℃下，8 000 r/min离心15 min沉淀RNA，倾去上清。

⑩将RNA沉淀重悬于5 ml变性液中，为加速溶解，可65℃短时加热。

11）重复⑧、⑨步。

12）用75 % 的冷乙醇洗RNA沉淀2遍。

13）RNA沉淀在真空抽干机中干燥15~20 min，但不要完全干燥，以免难以溶解。

14）将RNA溶于1 ml无Rnase的去离子水中，―20℃贮存。如欲长期保存，可加