微生物遗传操作系统

转化 Transformation
细菌细胞处于可被DNA转化的状态称为感受态。 转化的状态称为感受态 处于感受态的细胞表面有DNA受体和其他特异的转化蛋白。
(1) 自然感受态： 自然感受态 (2) ( ) 化学感受 化学感受态： (3) 电转化/电穿孔 (4) 原生质体转化
接合转移 Conjugation j g
Conservative transposition
剪-贴型/保守转座
?
• Cut and Paste transposition: p The element itself moves from the donor site into the target site
• Tn5, T 5 Tn10 T 10
接合转移的基本元件
1. 接合起始区origin of transfer ( oriT or mob) ：位于待接合 的质粒上。 的质粒上 2 接合转移基因(tra genes): 2. tra基因可以位于待接合的质粒上，也可以位于供体菌的另 一个质粒，甚至可以位于细菌基因组上 个质粒 甚至可以位于细菌基因组上 。
+
Hyperactive Tn5 TnpA
EPICENTRE Technologies
应用1， 直接诱变细菌基因组
• • EZ::TN Transposomes provide an efficient and reliable method for generating a library of random gene knockouts in vivo Gene inactivation and examination of the resulting phenotype will identify the function of the interrupted genes
等渗溶液！！！！
细菌ຫໍສະໝຸດ Baidu壁：
细菌细胞壁主要为肽聚糖. •加甘氨酸/青霉素培养，抑制肽聚糖的合成； •加溶菌酶处理除去肽聚糖。 加溶菌酶处理除去肽聚糖 溶菌酶：切开肽聚糖中 溶菌酶 切开肽聚糖中NN 乙酰葡萄糖胺和NN 乙酰胞壁酸之 间的β-1,4-糖苷键。
原生质体再生：
原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构 原生质体重新长出细胞壁 恢复完整的细胞形态结构 和功能。
Mg g2+ Mg2+ or Mn2+
Transposome
(released synaptic ( y p complex) p )
Review, Mol. Micro. 2003,47, 1199–1206
Tn5 边界序列
ME
EZ::Tn transposome转座体的合成
任何DNA
PCR product
Retrotransposition: The element makes an RNA copy of itself which is reversed reversed-transcribed transcribed into a DNA copy which is then inserted (cDNA).
转化、转导与接合转移
最终受体菌
基因转移
重组DNA分子
微生物遗传操作系统
《微生物菌种选育》 Genetic Improvement on Microorganisms
基因转移
转化Transformation: 细胞从环境中摄取DNA。只 有“感受态”细胞才能摄取DNA。 转导Transduction: 病毒感染一个细胞后部分宿主 DNA被包到新生病毒粒子中，该病毒粒子再感染另 被包到新生病毒粒子中 该病毒粒子再感染另 一个宿主细胞从而引起基因重组的现象。 接合Conjugation: 一个细菌通过细胞间的直接接触 个细菌通过细胞间的直接接触 将DNA转到另外的细菌中，接合需要特殊的质粒辅 助。
无性进化 Asexual evolution
deleterious mutations
Fig. Asexual versus sexual evolution.
Figure 2a Genome shuffling versus classical strain improvement. improvement
复制性转座Replicative transposition
• Replicative transposition: The element moves a copy of itself to a new site via a DNA intermediate •TnA （Tn3）
逆转录转座/返座Retrotransposition
细菌的复合转座子
From Wikipedia
•These inverted repeats (IR) act as the substrates for recombination reactions mediated by the transposase
Three different mechanisms for transposition • Cut and Paste/Conservative transposition: • Replicative transposition: • Retrotransposition Most DNA transposons p move through g a nonreplicative mechanism.
转 导 Transduction
细菌利用噬菌体通过转导作用 将基因组DNA转 移到另 个细菌中 移到另一个细菌中。
转 染 Transfection
当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是 病毒DNA时此过 程就应该称为转染。区别于 感染 ，后者指病毒颗粒借助 程就应该称为转染。区别于“感染”，后者指病毒颗粒借助 于胞外受体吸附到细胞，并将DNA注入细胞。 而对于真核生物，转染就是原核生物中转化的同义词。 之所以在真核生物中使用“转染” 之所以在真核生物中使用 转染 这个词来代替“转化”， 这个词来代替 转化 ， 是因为人们之前已经习惯了用转化这个词表示真核细胞变为 恶性细胞的过程。
链霉菌原生质体融合
PEG浓度很关键，最适浓度(W/V)依分子量/聚集度而定。 同一浓度下高分子量者具有更低的渗透压但粘度更高。 实际常用分子量为1000-6000，1000 更好，使用浓度50 %。很 少用60%以上的PEG, 因为过于粘稠。 钙离子 钙离子（由 P Buffer提供 提供） 融合时间几分钟即可。 融合前用紫外照射适当处理（1%存活率），可提高重组频率。
微生物原生质体融合
（Protoplast Fusion）
将两个亲本的原生质体在等渗溶液中混合，加 将两个亲本的原生质体在等渗溶液中混合 加 入物理的（电融合）、化学的（聚乙二醇）或生物 的（仙台病毒）助融条件 使两个亲本的原生质体 的（仙台病毒）助融条件，使两个亲本的原生质体 发生相互凝聚，通过细胞质、细胞核融合，产生暂 时的核 质异质体/异核体，继而发生基因组间重 时的核、质异质体 异核体 继而发生基因组间重 组，最后再生出细胞壁得到重组子。
a: Comparison of classical strain improvement to genome shuffling for production of tylosin from S. S fradiae. SF21 was generated through 20 rounds of mutagenesis and screening from SF1. GS1 and GS2 were generated from two rounds of genome shuffling of a population of classically improved strains derived from SF1. The classical approach pp required q twenty yy years and approximately a million screens, whereas genome g required q only yay year and shuffling 24,000 screens.
原生质体及 原 质体融合 原生质体融合
《微生物菌种选育》 Genetic Improvement on Microorganisms
原生质体概念
Protoplast: 用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁 用溶菌酶除 原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁 的合成，所留下的仅由细胞膜包被着的脆弱细 胞 主要是G+ 菌 胞，主要是
转座在微 物育种中的应用 转座在微生物育种中的应用
《微生物菌种选育》 Genetic Improvement on Microorganisms
细菌的转座因子
• • • •
插入序列 Insertion sequence (IS) 转座子Transposons (Tn) 接合型转座子 转座噬菌体如 Mu
转座共同特点
• 不依赖供体序列与靶点序列间的同源性 • 转座插入的靶点并非完全随机 • 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复Target Site Duplications p (TSDs), ( ), • 正向重复是由转座酶对靶位点进行交错切割导致的 • 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应，如 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应 如 靶位点基因失活。
指两个细胞通过直接接触或桥状结构进行基因转 移的过程。 接合转移需要利用质粒编码的功能辅助。
http://strubi.uni-graz.at/projects/index.html
接合转移质粒 Conjugative plasmid
含有接合转移质粒的细菌才能发生接合转移。 大肠杆菌F质粒 大肠杆菌RK2/RP4质粒 农杆菌Ti质粒
抗生素抗性基因
Transposase
tnpA
3 EZ::Tn transposome 3. 转座体技术
EPICENTRE Technologies
Tn5 转座机理
Transposome
Synaptic complexes are formed after Tnp binds to the ends and then di dimerizes i forming f i both b th T Tnp–Tnp T and d trans Tnp–DNA contacts.
Sphaeroplast: p p 还残留有部分细胞壁的原生质体，主要是G- 菌 广义概念： 广义概念 实验室条件下脱掉部分或全部细胞壁的植物 真菌 细菌细胞 实验室条件下脱掉部分或全部细胞壁的植物、真菌、细菌细胞。
链霉菌菌丝
原生质体
Hopwood,2007
原生质体特点： 原生质体特点
1. 无细胞壁。 无细胞壁 2. 球形。 3. 脆弱。 4. 对渗透压敏感。 高渗的溶液将导致原生质体缩小。 低渗导 致原生质体破裂。
促融合剂：
PEG(polyethylene (p y y g glycol) y ) 聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。 动物细胞融合：仙台病毒、羟基磷灰石、PEG PEG对细胞尤其是原生质体有一定的毒害作用，因此作用的时 间一般不宜过长。微生物的原生质体只需要与PEG接触5分钟， 就应尽快加入缓冲液进行稀释。
EPICENTRE Technologies
应用2， 两步法转座诱变细菌基因组
基因组文库 链霉菌 粘粒克隆 感受态
突变基因组文库
链霉菌突 变体库
基因功能解析
N l i Acids Nucleic A id Res. R 2004
鉴定转座插入位点的常用方法
• Genome sequencing • Tn rescue and sequencing • tail PCR and sequencing • LM-PCR and sequencing
如何用转座子诱变？
• 转座因子插入 转座因子插入、切除导致转座位点 切除导致转座位点DNA序列改 变。 • 转座发生后，插入位点两侧的序列可以利用转 座子内部已知序列查找鉴定。 -⎯转座子标签
1. 转座子载体
Amr
Transposase
2 微型转座子载体 2.
Mini-transposon p