第六章酶工程制药

一、固定化酶的制备
固定化酶的缺点： （1）固定化时，酶活力有损失。 （2）增加了生产的成本，工厂初始投资大。 （3）只能用于可溶性底物，而且较适于小分子底物，对大分子底物不适宜。 （4）胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。 （5）与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。
一、固定化酶的制备
一、固定化酶的制备
酶和细胞的固定化载体主要有以下3类：
（1）吸附载体 ： 用于吸附法制备固定化酶，有物理吸附和离 子吸附。物理吸附所用的载体有无机物和有机物。 （2）包埋载体： 工业上应用的包埋载体主要为卡拉胶、海藻胶等。 （3）交联载体： 交联法与吸附法和包埋法所用的载体相同。
二、固定化细胞的制备
3．酶的固定化方法与制备技术：
按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为：
（1）载体结合法 （2）包埋法 （3）交联法
一、固定化酶的制备
（1）载体结合法 载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的—种固定化方法。根据 结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等三 种。
一、固定化酶的制备
（2）交联法
一、固定化酶的制备
4．酶和细胞的固定化载体
在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物称为载体或基质。
固定化载体种类很多，其来源、结构和性质各不相同。因此在固定化 过程中，需根据酶促反应性质、底物类型及固定化方法，选择相应的载 体或基质。
一、固定化酶的制备
固定化过程中使用的载体需符合如下条件： （1） 固定化过程中不引起酶变性； （2） 对酸碱有一定的耐受性； （3）有一定的机械强度； （4） 有—定的亲水性及良好的稳定性； （5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； （6）共价结合时具有可活化基团； （7） 有耐受酶和微生物细胞的能力； （8） 廉价易得。
二、固定化细胞的制备
2. 固定化细胞的特点 固定化细胞既有细胞特性，也有生物催化剂功能，又具有固相催化剂待点。 其优点在于： （1）无需进行酶的分离纯化。 （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高。 （3）细胞内酶比固定化酶稳定性更高。 （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生。 （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。 （6）抗污染能力强。
四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质
（2）纤维状固定化酶
某些材料，如三醋酸纤维素，用适当的溶剂溶解后与酶混合， 再采用喷丝的方法就可制成酶纤维。如将含酶的甘油水溶液滴入 三醋酸纤维素的二氯甲烷溶液中，乳化后经喷丝头喷入含丙酮的 凝固液中即成为纤维状，取出后真空干燥即得固定化酶。 纤维状固定化的的比表面积大，转化效率高，但只适用于填充 床反应器。酶纤维也可以织成酶布用于填充床反应器。
二、固定化细胞的制备
2. 固定化细胞的特点
固定化技术的局限性： （1）利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物 （2）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。 （3）载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。
二、固定化细胞的制备
3. 固定化细胞的制备技术 细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，其制备方法和应用方法也 基本相同，但细胞的固定比主要适用于胞内酶，要求底物和产物容易透过细 胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应；若存在副反应，应具有相 应的消除措施。 固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法等。
固定化酶（immobilized enzyme）是指限制或固定于特定空间位置 的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失 即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程 称为酶的固定化。
一、固定化酶的制备
2．固定化酶的特点： 固定化酶的最大特点是既具有生物催化剂的功能，又具有 固相催化剂的特性。 与天然酶相比，固定化酶具有下列优点： （1）酶的稳定性提高。 （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶， 易于纯化，产品质量高。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续和自动控制。 （4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。 （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。
目前工业生产一般都以微生物为主要来源，目前在千余种被使用的商 品酶中，大多数都是利用微生物生产的。
2. 人工合成
二、酶的来源
利用微生物生产酶制剂的优点： （1）微生物种类繁多，酶的品种齐全，可以说一切动植物体内存在 的酶几乎都能从微生物中得到。 （2）微生物繁殖快、生产周期短、产量高。 （3）培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可 以通过控制培养条件来提高酶的产量。 （4）微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异 的手段，培育出新的高产菌株。
四、酶在医药领域的应用
2.在疾病治疗方面的应用 由于酶具有专一性和高效率的特点，所以在医药方面使用的酶具有 种类多、用量少和纯度高等特点。 主要的医药用酶有： （1）蛋白酶主要用于消化不良和食欲不振等。 （2）溶菌酶具有抗菌、消炎、镇痛等作用。 （3）超氧化物歧化酶，具有抗辐射作用。 （4）L-天冬酰胺酶用于治疗白血病。 （5）尿激酶具有溶血栓的活性。 （6）其他相关酶制剂，如细胞色素C等。
第六章
酶工程制药
第六章
酶工程制药
第一节 第二节
概 述 酶和细胞的固定化
第三节
第四节
固定化酶和固定化细胞的反应器
酶工程研究的展望
第一节
概 述
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一、酶工程简介
二、酶的来源
三、酶的生产菌
四、酶在医药领域的应用
一、酶工程简介
1. 酶工程（enzyme engineering）的概念： 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是
四、酶在医药领域的应用
3.在药物生产方面的应用
酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转为 药物。
主要的应用有： （1）利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素； （2）利用β-酪氨酸酶制造多巴 （3）利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷 （4）利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。
四、酶在医药领域的应用
四、酶在医药领域的应用
1.在疾病诊断方面的应用 酶学诊断方法可靠、简便、快捷，在临床诊断中已被广泛使用。 酶学诊断包括两个方面： 一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷 丙转氨酶活力升高来诊断肝炎； 二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖 氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。
三、固定化方法与载体的选择依据
载体的选择还应考虑底物的性质。
固定化方法具有多样性。
四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质
1．固定化酶与固定化细胞的形状
已有多种物理形状的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纤维、 微囊和颗粒状的固定化酶。
颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。 制造何种形状的固定化酶，需要根据底物和产物的性质、 基质材料的性能、固定化的方法、酶反应的性质、反应器的类 型和应用目的来决定。
三、酶的生产菌
3．生产菌的来源 （1）菌种保藏机构和有关研究部门； （2）从自然界中分离筛选。 自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是 菌种采集地。
4. 筛选产酶菌的方法主要包括以下几个步骤： 菌样采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。 为了提高酶的产量，在酶的生产过程中应不断改良生产菌。主要应用 遗传学原理进行改良，其基本途径有：基因突变、基因转移和基因克隆。
三、酶的生产菌
1．酶的发酵技术： 有目的地利用微生物生产酶的方法称为酶的发酵技术。 2. 作为酶制剂的生产菌应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且 最好是产生胞外酶的菌； （2）不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生 有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要； （3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质
（1）颗粒状固定化酶
颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。
每种固定化方法均可制备颗粒状的固定化酶，制备方法简单， 颗粒比表面积大，转化效率高，适用于各种类型的反应器。 如海藻胶溶液和酿酒酵母的混合液经喷珠机压入到CaCl2溶液 中即可制成固定化的酵母酶珠，可用于工业化中乙醇的大规模生产。
1. 固定化细胞的定义
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。
被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶 一起被称为固定化生物催化剂。
固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，它的实际应用比固定化酶更为普遍。
细胞固定化技术的应用比固定化酶更为普遍，已在医药、食品、 化工、医疗诊断、农业、分析、环保、能源开发及理论研究的应用 中取得了举世瞩日的成就。
四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质
（3）膜状固定化酶 膜状固定化酶也称为酶膜，可以通过共价结合法将酶偶联 到滤膜上制备，也可以将酶和某些材料如火棉胶、硝酸纤维素 、骨胶原和明胶等，用戊二醛交联或其他方法处理后制成膜状。 酶膜的表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可 用于填充床反应器。 目前已制备出木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、氨基酰 化酶和脲酶等多种酶膜。
4. 在分析检测方面的应用 用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。 酶法检测可以分为单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等三类。
第二节
酶和细胞的固定化
一、固定化酶的制备 二、固定化细胞的制备 三、固定化方法与载体的选择依据 四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质
一、固定化酶的制备
1．固定化酶的定义：
三、酶的生产菌
5．目前常用的产酶微生物： 大肠杆菌（E．coli）用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰 化酶、β—半乳糖苷酶等。 枯草杆菌主要用于生产淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶 酵母主要用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。 曲霉（黑曲霉和黄曲霉）可用于生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。 青霉主要用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5’—磷酸二酯酶、 脂肪酶等的； 根霉主要用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶 木霉主要用于生产纤维素酶 链霉菌主要用于生产葡萄糖异构酶等
交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之 间交联的固定化方法。
常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺—2,2—二磺酸、1,5—二氟 —2,4—二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。
交联法又可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载 体交联法4种。
一、固定化酶的制备
（3）包埋法 包埋法可分为网格型和微囊型两种。 将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型； 将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。
从应用的目的出发研究酶，应用酶的特异性催化功能并通过工程化将
相应原料转化成有用物质的技术。
一、酶工程简介
2. 酶工程主要研究内容： （1） 酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发； （2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）； （3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究； （4）酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究； （5）有机相中酶反应的研究； （6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究； （7）抗体酶、核酸酶的研究； （8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。 酶工程技术和应用研究在工业、农业、医药和食品等方面发挥着极其重 要的作用。
二、酶的来源
1. 直接从生物体抽提分离（动物、植物、微生物）
动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪的凝乳酶等。 植物提供的酶主要有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动植物原料的生长周期长、来源有限，又受地理、气候和季节等因素 的影响，不适于大规模生产。
近10多年来，动植物组织和细胞培养技术取得了很大的进步，但因 其周期长、成本高，因而还有一系列问题正待解决。
三、固定化方法与载体的选择依据
1．固定化方法的选择 应考虑下述几个因素来选择固定化的方法： （1）固定化酶应用的安全性 （2）固定化酶在操作中的稳定性 （3）固定化的成本
三、固定化方法与载体的选择依据
2．载体的选择 最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体， 如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶等。另外离子交换树脂、金属 氧化物及不锈钢碎屑等，也都是有应用前途的载体。