酶的发酵生产

• 2. 液体深层发酵 • 液体表面发酵，目前已不采用。 • 液体深层通风发酵， • 主要设备是一个具有搅拌桨叶和 通气系统
的密闭容器。
• 优点：①产酶纯度高，质量稳定；
• ②较易控制发酵条件，有利于自动化控制； ③机械化程度高，劳动强度小；设备利用 率高。
• 缺点：设备投资较大。
• 3. 固定化细胞发酵
• 厚层通气法：将固体培养基接入菌种后，平 铺在具有多孔的大池内，厚度可达20-30厘米； 待微生物已开始生长，即从池底通入一定温 度和相对湿度的空气，使微生物比较均匀适 宜地生长繁殖和产酶。
优点：①设备简单，投资较少。②环境污染 少；③特别适用于霉菌的培养和发酵产酶。
缺点 ：①劳动强度大；②原料利用率低；③ 产酶纯度较差；提取精制较难；④传质传 热效率低，发酵条件不易控制均匀，产酶 不稳定；⑤不宜胞内酶生产（菌体分离难 度大）
酶合成转录水平上的调节
底物和代谢产物对基因活性的调节（诱导、 阻遏）
编码蛋白质和淀粉等分解酶的基因。 合成各种细胞代谢过程中所必需的小分子物
质（如氨基酸、嘌呤和嘧啶）的酶的基因。
• 弱化子对基因活性的调节（转录弱化作用）
某些酶基因的起始密码前有一段一定长度的 mRNA片断（前导区），此mRNA片断通过自 我配对可行成茎环结构，负载特殊氨基酰— tRNA的浓度影响了其在mRNA上的位置，从 而决定了mRNA的二级结构，达到微调基因转 录的目的。该片断的缺失会提高酶的表达量。
来源于中温性和嗜热性微生物的耐热蛋白酶
来源
Bacillus Licheniformis
B.stearothermophilus NCIB 8924 B.thermoproteolyticus
生长温
度(℃)
37
酶在生物 体外的保 温温度(℃)
70
半衰期 *(min)
10
55
74
15
55
80
60
Thermus aquaticus 75 T351
cAMP：cAMP+H2O→ADP→ATP）， 结果启动子上没有cAMP－CRP复合物结合，RNA聚
合酶也就无法结合到启动子的位点上。
• P启动子包括两个结合位点：RNA聚合酶结 合位点，cAMP－CRP复合物结合位点
第三节 酶的发酵生产技术
• 一、微生物发酵产酶方式 1. 固体培养 定义：利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷
• 细菌的应急反应
当氨基酸全面匮乏时，细菌产生应急反应，包括生 产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部 生物化学反应过程均被停止。
信号是鸟苷四磷酸和鸟苷五磷酸。
产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。
当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸 的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶， 使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。 ppGpp的出现关闭许多基因，打开一些合成氨基 酸的基因，以应付这种紧急状况。
• Aspergillus oryzae：淀粉酶，中性蛋白酶，果胶酶， 氨基酰化酶、脂肪酶，磷酸二酯酶
• Rhizopus：糖化酶，转化酶，脂肪酶，酸性蛋白酶， 半纤维素酶
• Mucor：蛋白酶，糖化酶，脂肪酶，凝乳酶
• Penicillium（产黄青霉）：葡萄糖氧化酶，青霉 素酰化酶，果胶酶，纤维素酶，桔青霉，5‘－磷 酸二酯酶，脂肪酶，葡萄糖氧化酶，核酶酶，凝 乳蛋白酶，
粗淀 粉 76.6 73.0 55.4 38.5 26.7 21.4 52.5 55.0 40.0
粗蛋 白 6.1 8.5 13.5 16.0 2.6 1.2 2.7 5.7 4.5
粗脂 肪 0.5 4.3 3.8 18.5 0.1 0.4 —— —— ——
粗纤 维 1.4 1.3 10.4 7.0 0.9 1.1 11.5 —— 0.9
• ① 动植物细胞体积大、对剪切力敏感，要求特 殊生物反应器。
动物细胞培养方法：悬浮培养，依附培养，固定 化细胞ห้องสมุดไป่ตู้养。
植物细胞培养方法：悬浮培养，摇瓶，通用式发 酵罐，气升式、鼓泡式、旋转圆筒式。
• ② 动植物细胞生长速率、代谢速率低，发酵周 期长，对防止杂菌污染的技术要求高。
• ③ 动物细胞营养要求苛刻
植酸酶 黑曲霉，毕赤
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
纤维素酶
里氏木霉、黑曲 霉
水洗布生产，饲料添加剂， 消化植物细胞壁
半纤维素 木霉、曲霉、根 饲料添加剂，消化植物细
酶
霉
胞壁，低聚木糖生产
β葡聚糖 酶
枯草芽胞杆菌，黑曲
霉，Penicillium
emersonii
啤酒酿造，饲料添加剂
异淀粉酶
豆 饼 12.5
粗淀 粉
27.5
粗蛋 白
43.0
粗脂 肪
11.5
粗纤 维
产气克雷伯氏菌， 芽孢杆菌
淀粉加工
乳糖酶
乳酸酵母，米曲霉， 乳品工业（处理牛乳和乳
黑曲霉，米根霉
清）
果胶酶
曲霉、欧文氏菌
水果加工，果汁、果酒澄 清，麻类纤维脱胶
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
转化酶 啤酒酵母、假丝酵母 制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉,大肠杆菌和 真菌生产的重组酶
制造乳酪
脂肪酶
曲霉、根霉、酵母等
80
1800
4.菌种的衰退和复壮
• 1）退化的原因 • ①环境条件引起
• ②自身突变引起
• 2）菌种退化的防治 • ①菌种选育 • ②保藏方式 • ③培养条件 • ④管理措施
第二节 酶生物合成调节的基本理论
• 酶的生物合成：酶在生物体内产生的过程。 • 酶的发酵生产：通过人工操作控制，利用
细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物 细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的 过程。
• 利用石油为碳源进行酶制剂发酵的例子， 菌 种：铜绿色假单孢菌 培养基：10%的重油，以及其它无机盐 条 件：pH7.0，28℃ 培养5天 结 果：得到中性、半碱性和碱性蛋白酶
• 2 氮源： 角色：蛋白质（包括酶）和核酸的主要元素。 种类：无机氮，有机氮
几种常用有机氮源成分（近似%）
原料名 水分 称
• 定义：酶催化作用的产物或代谢途径的未 端产物使该酶的生物合成受阻的过程。
①限制曲霉培养基中磷酸盐浓度可增加核酸 酶、磷酸酯酶、植酸酶的生产30到50倍。
② 色氨酸的过量积累，对色氨酸合成途径中
的5种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。E、 D、C、B、A分别为邻氨基苯甲酸合成酶、 邻氨基苯甲酸磷酸转移酶，邻氨基苯甲酸 异构酶，吲哚甘油-3-磷酸合成酶，色氨酸 合成酸 。
三、培养基
培养基：人工配制的用于细胞培养和发酵的 各种营养物质的混合物。
培养基设计考虑：①菌种特性 ②不同培养阶段 ③产物 ④原料来源难易。
培养基的种类： ①营养物质来源不同：天然、合成、半合成 ②物理状态不同：液体、固体、半固体 ③功能用途不同：基础、加富、选择、鉴别
• 培养基的营养成分： • 碳源 • 氮源 • 无机盐 • 生长因子 • 产酶促进剂
枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌 α-淀粉酶 米曲霉
淀粉液化，织物退浆， 消化助剂，加酶洗涤剂
葡萄糖淀 米曲霉，黑曲 制造葡萄糖，发酵、酿
粉酶
霉，米根霉 酒等工业的淀粉水解糖
中性蛋白 酶
枯草芽胞杆菌， 米曲霉
皮革、毛皮加工，食品 加工，调味品制造、助 消化、消炎、啤酒澄清
碱性蛋白 酶
地衣芽胞杆菌
加酶洗涤剂
壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供微 生物生长和产酶用。 浅盘法、转桶法、厚层通气法
• 浅盘法：将固态培养基平铺在浅盘（多为木 盘或竹匾）内，厚约3-5厘米，在能够控制湿 度、温度的曲房里进行发酵。
• 转桶法：将固态培养基接入菌种后，放在可 旋转的转桶内，当桶慢慢转动时，培养基即 在转桶内翻动，通气及温湿度调节较为均匀， 有利于微生物的生长和产酶。
分枝酸
色氨酸
分解代谢物阻遏
• 定义：容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是 诱导酶）生物合成的现象。
葡萄糖阻遏－半乳糖苷酶的生物合成机理： 葡萄糖的大量存在，降低了胞内cAMP浓度 （①葡萄糖抑制腺苷酸环化酶活性，降低cAMP生成：
ATP→cAMP+Pii； 或 ② 葡 萄 糖 存 在 引 起 ATP 浓 度 上 升 ， 消 耗 胞 内
2．常见酶发酵生产用微生物
• Bacillus subtilis：-淀粉酶，中性蛋白酶 • Esherichia coli（胞内酶）：－半乳糖苷酶，谷氨
酸脱羧酶，天门冬酸酶，苄青霉素酰化酶，限制性 核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶，核酸外切 酶
• Aspergillus niger：糖化酶，果胶酶，纤维素酶， 半纤维素酶，葡萄糖，氧化酶，酸性蛋白酶，柚苷 酶，
乳糖操纵子模型
1960年，Jacob和Monod 操纵子：结构基因、调节基因、启动子和操作子
DNA
lacI
PO LacZ
LacY LacA
1040bp 82bp 3510bp 780bp 825bp
mRNA
多肽 38kDa
蛋白质 114kDa 阻抑蛋 白
125kDa
500kDa β—半乳 糖苷酶
30kDa 30kDa
• 优点：①固定化细胞的密度大，反应器生产强度 大；②发酵稳定性好，可以连续使用较长时间， 易于连续化，自动化生产；③可在高稀释率的条 件酵液下含连菌续体发较酵少（，D＞利μ于m产）品,提分高离设。备利用率；④发
• 缺点：①不能强烈搅拌； ②技术要求高，传质传 热效果差（氧气供给，温度控制。培养基成分的 控制）；理论研究阶段； ③只适用于胞外酶的生 产；
• 1 碳源： 角色：①能量；
②细胞和各种代谢产物的碳架 种类：淀粉及其水解物（主要），烷烃、甲醇
几种农副产品和野生淀粉质原料成分（近似%）
原料 水分 名称
甘薯干 12.9 玉 米 12.0 麸 皮 12.1 米 糠 11.5 马铃薯 68.5 木 薯 70.3 土茯苓 10.8 橡 子 11.0 石 蒜 ——
灰分
2.4 1.7 4.8 5.5 1.2 0.5 2.3 —— 9.7
对发酵的影响：①营养②对酶生物合成的 代谢调节（诱导，反馈阻遏，分解代谢物 阻遏）
• 举例：用链霉菌发酵生产葡萄糖异构酶， 以1%葡萄糖为碳源，1.75单位/ml培养液； 以1%木聚糖为碳源，21.92单位/ml培养液； 以0.25%木聚糖为碳源，14.56单位/ml培养液。
• Trichoderma：纤维素酶，17-羟化酶
• Streptomyces：葡萄糖异构酶，中性蛋白酶，几 丁质酶
• Saccharomyces cerevisiae：转化酶
• Candida：脂肪酶，转化酶，尿酶，乳糖酶
• 脆壁酵母：乳糖酶
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶
产酶微生物 用途
加酶洗涤剂，油脂加工， 生物化工
葡萄糖氧 化酶
青霉、曲霉
食品去氧、除葡萄糖， 测定葡萄糖
葡萄糖异 构酶
凝结芽胞杆菌，白色 链霉菌
生产果葡糖浆
青霉素酰 细菌、霉菌、放线菌 制造6-氨基青霉烷酸
3、菌种分离
1）高产酶的菌种收集：土壤；发酵生产材料； 菌种保藏中心。 CCICC，ATCC
2）富集培养
3）菌种纯化
微生物细胞
细菌
酵母
霉菌
1～10
025～ 1
1.15～ 2
简单
2～6.9
有
大多不敏感
醇、有机酸、氨基酸、核苷 酸、抗生素、酶多糖、色素、
菌体
植物细胞
20～300 20～74
较简单 有，坚硬
敏感 色素、香 精、药物
动物细胞
10～100 15～100
复杂 无 很敏感 激素、疫 苗、单克 隆抗体
动植物细胞培养缺点
第三章 酶的发酵生产
第一节 酶的生产菌种
• 1．酶发酵生产的细胞必需具备如下条件 ①酶的产量高； ②产酶稳定性好； ③容易培养和管理；发酵周期短，营养需求
简单； ④产物杂质少，利于酶的分离纯化； ⑤安全可靠，非致病性。
1．不同类型、植物、动物细胞的特性比较
细胞大小 倍增时间
营养要求 细胞壁
对剪切力 主要产物
30kDa 60kDa 透过酶 乙酰转
移酶
诱导作用
• 定义：加进某种物质，使酶的生物合成开始或 加速进行的过程。
•酶
基质
基质结构类似物
-半乳糖苷酶 乳糖(+)
异丙基巯基--D-半乳糖苷(+)
安慰性诱导物
诱导作用的证实 同位素示踪实验： 大肠杆菌，放射性标记的氨基酸， 半乳糖苷诱导物
•酶
基质
产物
葡萄糖淀粉酶 淀粉(+)
麦芽糖，异麦芽糖(+)；葡萄糖(-)
脂肪酶
油脂(+)(-)
脂肪酸(-)
纤维素酶 纤维素(+)
葡萄糖(-)
酶 α-淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 转化酶 普鲁兰酶 木糖异构酶
某些商业酶的诱导
底物
诱导
淀粉
淀粉或麦芽糊精
淀粉
麦芽糖或异麦芽糖
蔗糖
蔗糖
普鲁兰
普鲁兰或麦芽糖
木糖
木聚糖或木糖
反馈阻遏作用