zzj-4-蛋白质4

胰岛素治疗人的糖尿病。
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3、蛋白质的一级结构与分子病（p267）
蛋白质一级结构的突变导致分子病
分子病：由于基因突变导致机体合成蛋白质一级结构的 改变，从而引起生物功能的障碍，而产生先天性疾病， 这就是分子病。
最典型的例子是镰刀形贫血病
在正常人的血红蛋白β -链N末端第6位aa是Glu，而在镰
刀形贫血病人中血红蛋白β -链N末端第6位aa是Val。
硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，
酶的催化活性完全丧失。 当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部 分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。 若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全
丧失活性。
这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构， 而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。
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三、蛋白质的沉淀作用
2.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的 有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。
有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。
有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机 溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。 3.重金属盐沉淀（条件：pH 稍大于pI为宜）：在蛋白质溶 液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。
蛋白质的变性定义：在变性因素作用下，使蛋白质的高度规 则的天然构象发生变化的这种过程，导致其生物功能的丧失 及物理、化学性质的改变，这种现象（过程）叫做蛋白质的 变性。主要是指生物功能的丧失，但一级序列没有变化。 蛋白质的构象变化：可分为正常变化和异常变化。正常变化 是指蛋白质在发挥其生物功能时，所必须的构象改变。异常 变化不是蛋白质发挥生物功能时所必须发生的功能改变。
PO2 Y 1Y K Y log log PO2 log K 1Y
p256
Log[Y/(1-Y)]=0 时 ,p(O2)=K=P50, 所 以 ， 在
log(Y/(1-Y))=0 这 一 点 的 斜 率
称Hill系数（nH)。 表示配体结合部位之间在结合 配体时的同促效应。
Hill曲线
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2、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质
在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。
p181
如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功
能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质一级结构（序列）上存在种属差异
这种一级结构的差异又不影响生物学功能；而结构决定 了功能，这种差异就一定是并不影响蛋白分子的空间构
12
p181
2、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
胰岛素
● 有24个氨基酸残基位置始终不变：A．B链上6
个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧
链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
● 其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用
不大，但对免疫反应起作用。
● 猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质混合物的分离方法 六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定
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一、蛋白质的两性电离和等电点
蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白
p291
质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可
34 Myoglobin
Juang RH (2004) BCbasics
协同效应
• 这种一个亚基与氧结 合后增加其余亚基对 氧的亲和力的现象称 为协同效应。 同促效应里的正协同效应
p261
35
p248
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2、 血红蛋白的氧合曲线
四个亚基之间具有正协同效应，氧合曲线是S型曲线。
p262
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• 开始，氧的结合要比肌红蛋白对 氧的结合慢（在脱氧血红蛋白中， 亚基之间的连接比较紧密），这 种构象不利于O2的结合，而当第 一亚基与氧结合后，增加了其余 亚基对氧的亲和力。 • 反之，当氧分压降低时，从氧合 血红蛋白失去一个氧分子，将引 起其余的氧分子更易解离，说明 各亚基间存在一种协同效应。
重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的 羧基结合。 重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属 作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体 48 吸收后造成对机体的损害。
4.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）
生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱 性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物 碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙 酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质 带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子 中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成 为不能被消化的“柿石”。 5.弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处 于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。 49
4
1、一级结构是空间构象的基础
• 蛋白质的空间构象的维持是靠次级键的作用，那么空间构 象的改变也主要是次级键发生的变化，有的也是二硫键的 变化。构象的改变与生物功能的丧失是蛋白质变性的核心。 • 蛋白质变性的种类： – 1、可逆变性：当除去变性物质后，蛋白质的构象又可 以恢复原状，生物功能也随之恢复的——复性。 – 2、不可逆变性：当除去变性因素时，蛋白质的构象不 恢复原状，生物功能也不恢复。
解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出 氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的 两性电离比氨基酸复杂。 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷 相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。
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二、蛋白质的高分子性质（p299）
象的变化。
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2、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质一级结构（序列）的特点： ① 同源蛋白质氨基酸序列具有明显的相似性（同源性）。 ② 有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不
变残基，不变残基高度保守，是必需的。
除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很 大变化，称可变残基，可变残基中的氨基酸变化不影响 蛋白质的功能。 ③ 多肽链长度相同或相近。
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（2）、 肌红蛋白的氧合曲线
p256
MbO2<===>Mb+O2
解离平衡常数：
[ Mb][O2 ] K [ MbO2 ]
[ Mb] PO2 K [ MbO2 ]
氧饱和度：
[ MbO2 ] Y [ MbO2 ] [ Mb]
PO2 Y K PO2
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3、 Hill曲线和Hill系数
（2）、胰岛素原的激活
胰岛素原 活性胰岛素，切除 C肽。
活性蛋白质
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Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.156
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一级结构与功能的关系
1、复性实验表明，蛋白质一级结构（氨基酸序列）决 定蛋白质的空间结构。 2、同源蛋白质的序列具有同源性，在空间结构上有功 能的位点一般是高度保守氨基酸。 3、蛋白质一级结构的变化导致空间结构的变化，可以 使蛋白质功能丧失。
生物化学
第四章 蛋白质
Proteins
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第五节 蛋白质的结构与功能
一、一级结构对蛋白质结构功能的影响 二、空间结构变化对蛋白质功能的影响
2
一、一级结构对蛋白质结构功能的影响
1、一级结构是空间构象的基础 2、同源蛋白质有顺序同源性 3、蛋白质的一级结构与分子病
4、前体与活性蛋白质一级结构的关系
3
1、一级结构是空间构象的基础（p233）
起其它亚基构象与功能上的变化，
叫变构效应。
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（1）血红蛋白的结构
不同的氨基酸序列也能规定出相似的三级结构
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接近于球 体，4个 亚基分别 在四面体 的四个角 上，每个 亚基上有 一个血红
素辅基。
29
30
任何亚基吸收氧分子后都会牵动骨架 p260
31
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.163 Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.486
4、蛋白质一级结构的切除是可以使蛋白质由非活性状
态转化成活性（激活）。
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二、空间结构对蛋白质功能的影响
1、肌红蛋白（Mb) 的结构与功能 2、血红蛋白（Hb)的结构与功能
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1、肌红蛋白（Mb)的结构与功能
（1）肌红蛋白的结构
p252
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p254
肌红蛋白的辅基铁卟啉
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疏水环境 的作用
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1、一级结构是空间构象的基础
p234
RNase变性——复性实验： • 牛胰RNase共有124个a.a残基。 4个链内二硫键。 分子量：12600 • 变 性 、 失 活(8M尿 素+b 硫基乙醇 )
→透析后，构象恢复，二硫键正确
复性的概率是1/7*1/5*1/3=1/105。
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变性的 RNase A 可以回复正常构形
Anfinsen
不正确折叠
- Urea, Mercaptoethanol
+ Urea, Mercaptoethanol
- Urea, Mercaptoethanol
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Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.38
变性的 RNase A 可以回复正常构形
RNase在蛋白质变性剂和还原剂存在下，酶分子中的二
肌红 蛋 白的 nH=1 ，表 示O2 分
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子彼此独立地与肌红蛋白结合。
2、血红蛋白（Hb)的结构与功能
在血液中结合并转运O2
p257
它由2a和2b四条多肽链构成，每个
亚基都含有一个血红素分子，血红 素中的二价铁原子在与氧结合的前
后，并不发生价数的改变。
通过观察发现血红蛋白与氧的结合 具有变构效应。 变构效应（allosteric effect):寡聚蛋 白中由于一个亚基构象的改变，引
p260
32
p261
氧气对R态血红蛋白的 亲和力明显高于T态
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血中氧分子的运送
任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力
氧 分 子
(R) relaxed state
Lung
环境氧浓度高时 Hb 快速吸收氧分子
动脉
环境氧浓度低时 Hb 迅速释出氧分子
Muscle 静 脉
(T) Hemoglobin tense state
p300
1. 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强 电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质 从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐 溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增 加，该现象称为盐溶。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净 电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使 蛋白质产生变性。
蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：
扩散慢、易沉降、 粘度大、不能透过半
透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体，具 有丁达尔现象。 蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、 带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中 从溶液中析出而产生沉淀。
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三、蛋白质的沉淀作用
使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：
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由于这个aa的差别，使血红蛋白溶解度下降至1/25，输氧功 能降低，使红细胞呈镰刀状，同时细胞易破碎。
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4、前体与活性蛋白质一级结构的关系（p185）
（1）血液凝固的机理 凝血因子（凝血酶原致活因子） 凝血酶原 血纤蛋白原 凝血酶 血纤蛋白
凝
块
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一级结构的部分切除是蛋白质功能激活的必要条件。
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Hb 4O2 Hb(O2 ) 4
p (O2 ) Y n p (O2 ) K
n
n介于1和4之间
Y log n log p(O2 ) log K 1 Y
nH=1,无协同性 nH＞1,正协同性 nH＜1,负协同性
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3、 波耳效应及其生理意义
位，因此，血红蛋白还能运输CO2 。
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2、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物
种间的亲源关系和进化。
亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。 进化论有了分子水平上的直接证据。
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2、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
细胞色素C
分子量：12500左右 氨基酸残基：100个左右，单链。 25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。 60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。 亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。 亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。 人与黑猩猩 人与猴 0 1 人与狗 人与酵母 10 44
p263
血红蛋白上有CO2和BPG（2，3-二磷酸甘油酸）结合部
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波尔（Bohr）效应有利于血红蛋白对氧的运输
HbO2 H HbH O2
血液流经组织 时，组织能比 因单纯氧分压 降低获得更多 的氧。
p264
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41
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p265
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第六节 蛋白质的分离纯化(p290)