蔗糖酶测定

蔗糖酶测定
1.分析意义：
蔗糖酶是根据其酶促基质----蔗糖而得名的。

又叫转化酶或β-呋喃果糖苷酶。

它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要的作用。

研究证明，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性。

如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关。

一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。

它不仅能够表征土壤生物学活性强度，也可以作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的一个指标。

2 方法选择及原理
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。

蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（滴定法或重量法）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量计算出糖的含量。

也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成的有色化合物进行比色测定。

还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。

3 比色法
3.1试剂配制
（1）20%蔗糖。

（2）甲苯。

（3）pH5.5醋酸盐缓冲液：取120ml冰醋酸用水稀释至1L（a），取164g无水CH3COONa 溶于水并稀释至1L（b）。

将（a）与（b）二液按1：8混合再用电位计校正pH。

（4）0.2M Na2HPO4·12H2O。

（5）钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a），再取200ml浓H2SO4加水800ml（b）。

使用前将两夜按1：1混合。

（6）铜试剂：取50g CuSO4·5H2O溶于500ml水中（a），取25g Na2CO3、25g酒石酸钾钠、20g NaHCO3和200g Na2SO4溶于水并稀释至1L再加几滴甲苯（b）。

使用前将两液混合。

（7）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58 O C条件下真空干燥至恒重。

然后取500mg溶于100ml甲苯酸溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。

再用标准液制成1ml含0.01—0.5mg葡萄糖的工作溶液。

3.2标准曲线绘制：
葡萄糖标准溶液稀释成1ml含1mg还原糖工作液。

然后，取不同体积（0.5——50ml）工作液移于100ml容量瓶中，加10mlpH5.5醋酸盐缓冲液，用水稀释至刻度。

吸取此液5ml 移于100ml容量瓶中，加4ml铜试剂。

在沸水浴上放置5min，冷却至室温。

再加2ml0.2M 磷酸二氢钠和5ml钼溶液，显色1min定容，在分光光度计上于578nm处比色。

根据密度值和浓度绘制标准曲线。

3.3 操作步骤：
取10g土壤置于100ml容量瓶中，加2ml甲苯。

15min后加10ml 20%蔗糖和10mlpH5.5醋酸盐缓冲液，置于370C恒温箱中培养24h。

培养结束后，过滤并定容，按绘制标准曲线的操作步骤显色，比色。

试验设用水代替基质的对照。

蔗糖酶活性，以24h10g土壤中葡萄糖毫克数表示。