蛋白纯化工艺

裂解操作注意点
１、缓冲液为 10mMTris-HCl-1mMEDTA PH8.0 2、菌体与缓冲液的比例为为1:8,这是质量体积 比 3、整个过程中缓冲液的温度要控制在１０℃以下, 如 温度超过,可以向裂解液中加冰或冷水浴的方法降温。
超滤浓缩（脱盐）
原理 利用压力或离心力，强行使水和其他小分子通过 半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐 的目的。 我们公司超滤膜的分子截留量为10000。 操作注意事项： １、进出口压力压力差保持为 20psi,如发现压力超过以 上数值,要立即停止操作,查明超压的原因并解决后方 可以重新操作,以免造成膜包损伤。 ２、超滤脱盐时要使溶液的电导小于0.2 × 103 us/cm.


裂解

裂解方法--化学渗透法
化学渗透法
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、 金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而 使胞内物质有选择地渗透出来。 EDTA螯合 EDTA 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的 外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质 来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将 脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填 补，从而导致内层膜通透性的增强。
重组人生长激素纯化工艺
纯化工艺流程图

菌体冻融
裂解
超滤浓缩
盐析

一次离心
Phenyl DEAE(Ⅲ)
二次离心
盐析离心
超滤脱盐
S-100
DEAE(Ⅰ)
DEAE(Ⅱ)


菌体冻融

原理：将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破 裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞 膨胀而破裂。 操作：将-２０℃冰箱冻存过夜的菌体取出放入常温,经过数小时 后将其完全冻融,然后再放置-20℃冰箱,冻存24小时后备用 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外， 在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
原理 是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一 种较为常用的方法。 不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性 作用力强弱不同，溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分 子与疏水层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将 待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度 选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗 脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。疏水 作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。 特点：高盐上样，低盐洗脱 操作过程：柱子处理 平衡 上样 洗脱 收集 后处理

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优点 疏水层析很适合作为离子交换纯化的下一 个步骤，因为疏水作用层析在高盐浓度下上样， 从离子交换得到的产物不需更换缓冲液即可使 用。蛋白又在低盐缓冲液中洗脱，又省去了下 一步纯化前的更换缓冲液的步骤，既节约了时 间，又减少了蛋白的丢失。
S-100凝胶过滤层析

原理 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被 分离物质的分子量大小不同来进行分离。层析柱中的 填料是某些惰性的三维多孔网状结构的珠状颗粒物， 多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，最后流 出小分子物质能进入内部网孔，在凝胶柱中经过的路 径长，最后流出，中等分子只能进入部分网孔，在凝 胶柱中所经过的路径相对较短,中等分子后流出较快， 而进不了网空的巨大分子物质却被排除在颗粒外部， 在凝胶柱中所经过的路径最短，最先流出。当一混合 溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同 分子量筛分开了。
原理：在一定的pH条件下不同的蛋白质所带 的电荷数不同，因而与阴离子交换介质的结合 能力强弱不同，当逐步提高离子浓度时结合力 弱的蛋白质先被洗脱下来，结合力强的后洗脱 下来，从而达到分离蛋白质的目的。 操作一般步骤：柱子处理 平衡 上样 洗脱 收集 后处理 特点：低盐上样，高盐洗脱。

Phenyl疏水层析

盐析
原理 由于大量的中性盐加入使水的活性降低，同时破坏 蛋白质表面的水化膜，使蛋白质表面疏水表面暴露出 来，由于疏水作用凝集而沉淀。 我们产品盐析利用的中性盐为硫酸铵，在粗纯盐 析硫酸铵饱和度为35﹪,精纯为45﹪。 操作注意点 溶解要完全，动作要温柔，避免造成蛋白质变性。

DEAE(Ⅰ)阴离子交换层析
DEAE(Ⅱ) DEAE(Ⅲ)阴离子交换层析
目的：进一步提高纯度，除掉内毒素。 原理和操作与DEAE(Ⅰ) 大致相同，只是缓冲液 改为5mMPB 。