动物饲料中氨基酸分析

应用方法开发报告：2013-RLC-SH-040 动物饲料中氨基酸分析

一、引言

蛋白质是生命过程的重要物质，是组成机体结构物质(细胞的组成)、体内代谢活性物质(激素、酶、免疫抗体)的主要成分，是组织更新、修补的原料。蛋白质占动物机体因形物总量的50％左右，肌肉、肝、脾、肾等实质器官的蛋白质含量可高达80％以上。由此可见。饲料中蛋白质的供应对畜禽生活和生产具有重要的作用，而蛋白质必须转化为氨基酸后才能为家畜和家禽等吸收利用。但目前少有对饲料中营养成分的研究报道。本研究采用酸性条件下水解饲料中蛋白质，柱前在线衍生与液相色谱紫外联用分析饲料中水解氨基酸。

二、实验部分

2.1 仪器与试剂

U3000液相色谱仪，恒温水浴锅，水解管（20ml）

甲醇、乙腈、水、三乙胺、四氢呋喃、乙酸钠、硼酸、氢氧化钠、邻苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯、3-巯基丙酸、硫代乙醇酸、苯酚、三氟乙酸、盐酸

17种氨基酸混标溶液（除胱氨酸浓度为1.25µmol/ml，其它氨基酸浓度为2.5µmol/ml）

表1 U3000液相色谱仪器配置信息

仪器型号UltiMate3000:

LPG-3400，SN:8014896

WPS-3000TSL, SN:8014671

TCC-3000, SN:801179

DAD，SN:8037084

变色龙®色谱管理软件（Chromeloeon®6.8 SR11）

色谱柱类型Hypersil GOLD C18色谱柱, 4.6×150mm, 5μm, PN:25005-154630，SN:11109020Q4

检测器工作参

数

检测波长：380nm，262nm, 3D扫描：190-400nm，采集频率：5Hz

流动相组成A: 20mM 乙酸钠（加0.018%三乙胺，调节pH值至7.2，再加入0.3%四氢呋喃），B：100mM乙酸钠（pH=7.2）-乙腈-甲醇（20:40:40）

进样参数自动进样器，1μl，温度：30o C

柱温设置35o C

表2 梯度洗脱程序

时间（min）B%

0 5

5 10

20 30

23 100

26 100

27 5

32 5

2.2 样品处理

7M盐酸：量取558ml盐酸，用水稀释至1000ml量瓶中，摇匀。

水解催化剂：称取1g苯酚置100ml量瓶中，加入7M盐酸50ml使溶解，再加入10ml 三氟乙酸和20ml硫代乙醇酸，用7M盐酸定容至刻度，摇匀，密封低温（4o C）保存。

饲料样品由第三方动物疾病预防机构提供，为不同类型（预混合、浓缩饲料）的动物配方饲料，含有不同种类的蛋白或氨基酸。

水解：称取0.5g样品转移至真空水解管中，加入1.0ml水解催化剂，充氮保护3分钟，密塞水解管并置于沸水浴上恒温加热8小时，冷却至室温，用40%氢氧化钠溶液调节pH值2-3范围内，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至10ml，摇匀并用微孔（0.22µm）滤膜过滤用于液相分析。

2.3 衍生程序

采用邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯在碱性条件下分别与一级氨基酸和二级氨基酸发生反应，生成具有强烈紫外吸收的化合物。衍生过程在自动进样器中进行。

衍生试剂：

硼酸缓冲液（0.4M,pH=10.5）:称取2.48g硼酸和1.41g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100ml 量瓶中。

邻苯二甲醛溶液（OPA）：50mg/ml(甲醇)

OPA/MPA溶液：0.8ml 硼酸缓冲液-0.2ml OPA溶液-20μl 3-巯基丙酸

氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液：2.5mg/ml（乙腈）

稀释液：流动相A

衍生过程：0.4M 硼酸缓冲液（5µL）+样品（1µL）+OPA/MPA溶液（1µL）+FMOC溶液（1µL）+稀释液（8µL）

三、结果

3.1方法专属性

取0.1N盐酸做为空白试剂考察方法专属性，结果见图1和2

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

32.0

-10

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d i l u

e n t

m A U

m i n

W V L :338 n m

图1 溶剂空白图谱

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

32.0

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

l e ve l 5

m A U

m i n A s p

G lu

H is

S e r

G ly T h r

A rg

A la

T y r

C y s

V a l M e

t P h e

Ile

L e u

L y s

P ro

W V L :338 n m

图2 标准品图谱

3.2 线性范围

取氨基酸混标溶液用1%盐酸（约0.1N ）稀释成浓度为0.02、0.05、0.10、0.25、0.50µmol/ml 的溶液，按照前述条件测定其响应值，并与浓度做线性回归，结果见表3。

表3 线性范围测试结果

编号 峰名称 校准类型 相关系数.(%) 截距 斜率 1

Glu

线性，有截距

98.589

0.0056

4.146