一种新的制备多克隆抗体的方法

A ne w methed for preparation of polyclonal antibodies
DENG RuiΟChun1 , ZHANG MingΟWei2 , BAI YunΟXiu2 , WANGJinΟSong2 , MAO Ning2
(1 Institute of Toxicology and Pharmacology , Beijing 100850 ; 2 Sinochem Institute of Biotechnodogy , Beijing 100850 , P. R. China)
1 材料和方法
1. 1 材料 rhEPO 纯化品由本室自制 ;人纤维肉瘤细胞 ( S180) 由本
院微生物流行病研究所辛颜彬提供 ;卡介苗购自北京生物制 品所 ;Protein GΟSepharose 4B 亲和柱为 Pharmacia 公司产品 ;紫 外分光光度计为 BECKMAN DUΟ600 ;酶联免疫测定仪为 BDSL Immunoskan 340 型 。昆明小鼠 ( KM) 和 Bal b/ c 小鼠购自本院 实验动物中心 。 1. 2 rhEPO 抗原纯化[1]
从注射 S180 细胞数目来看 ,对产生腹水 、血清效价无明 显影响 ,同时 ,抗体含量维持时间在本实验的加强免疫后为 14～33 天以上 。常规免疫实验中 ,一般选择加强免疫后 7～ 10 天放血 ,也即此时血中抗体含量最高 。这一时间差对本 实验采集腹水或血清效价有无影响 ,可否在注射 S180 细胞 之后再加强免疫 ,还有待进一步探索 。
表 1 S180 刺激 KM 小鼠产生抗 EPO 腹水
小鼠 S180 细胞 取腹水间 腹水量 血清量
编号 注射量/ 只 - 1 隔时间/ d
/ ml
/ ml
1
2 ×105
2
2 ×105
3
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 ×105
4
1 ×105
5
1 ×106
6
1 ×106
7
1 ×106
8
1 ×106
9
1 ×105
10
1 ×106
因为是首次试验这种方法 ,对采集时间的确定尚无经 验 ,所收集腹水量差别较大 。根据本试验观察 ,S180 细胞早 期在腹腔中可迅速增殖 ,直至使腹腔膨胀 ,到了后期 ,才较迅 速刺激腹水产生 ,所以采集腹水应尽量选择稍晚时期 。 2. 2 S180 细胞与 SP2/ 0 细胞比较
加强免疫后直接注入 S180 细胞和 SP2/ 0 细胞 ,比较两 种细胞在刺激产生腹水中有何异同 ,见表 2 。S180 细胞刺激 的 10 只 KM 鼠全部产生腹水 ,SP2/ 0 细胞刺激的 6 只 KM 鼠 无一只产生腹水 ,另有 5 只 Bal b/ c 鼠用 SP2/ 0 刺激也未产生 腹水 。
参考文献
1 张龙翔 ,张庭方 ,李令媛主编. 生化实验方法和技术. 第 2 版. 北 京 :高等教育出版社 ,1997. 175
2 李成文主编. 现代免疫化学技术. 上海 : 上海科学技术出版社 , 1992. 87
表 2 不同细胞诱生小鼠腹水效果比较
细胞数
鼠种
数量
腹水
S180 1 ×106 SP2/ 0 1 ×106 SP2/ 0 1 ×106
DM KM Bal b/ c
10
全部产生
6
无一产生
5
无一产生
上述结果显示 ,直接腹腔注射 S180 细胞即可刺激小鼠 产生腹水 ,而直接注射 SP2/ 0 细胞则不能刺激小鼠产生腹 水 ,SP2/ 0 骨髓瘤细胞要求小鼠预先用液体石蜡进行预处 理 ,才能刺激其产生腹水 。
邓瑞春等 :一种新的制备多克隆抗体的方法
·35 ·
只鼠最高可产 15 ml 以上 ,照这种采集量 ,3～4 只 KM 鼠产生 的腹水可相当于一只家兔产生的血清量 ,而 3 只鼠所用抗原 量以每 只 每 次 15 μg 计 , 经 5 次 免 疫 共 使 用 270 μg 纯 品 rhEPO ,而同样这一剂量免疫家兔很难获得如此高的效价 。 如果使用单克隆抗体技术 ,那么经 5 次免疫之后还要经细胞 融合 、阳性克隆筛选 、阳性细胞株亚克隆以及细胞扩大培养 、 腹水制备等复杂而漫长的过程 ,此外单克隆抗体还存在不可 回避的分泌抗体不稳定问题 。由此看来 ,采用 S180 细胞刺 激小鼠产生腹水获得抗体的方法是制备大量抗体的快速 、经 济 、实用的方法 。由于我们使用的是抗体亲和色谱法纯化的 高纯度 rhEPO 抗原 ,用此抗原制德的抗体完全可以用于制备 抗体亲和色谱柱 。
2. 56 ×104 5. 12 ×104 1. 6 ×105 6. 5 ×105
4 ×104 1. 6 ×105 6. 5 ×105 6. 5 ×105 2. 6 ×106 2. 6 ×106 1. 6 ×105 6. 5 ×105 6. 5 ×105 1. 6 ×105 1. 6 ×105 2. 6 ×105 2. 6 ×105 1. 0 ×104 1. 0 ×104 6. 5 ×105 6. 5 ×105
我们也利用 rhEPO 制备了鼠单克隆抗体 。从生产周期 看 ,免疫 5 次之后 ,至少要经过 1. 5～2 月时间 ,才能获得抗 体 ,由此看出利用 S180 细胞刺激产生腹水可以节省大量时 间和试剂 ,从另一方面降低成本消耗 。
当然该方法也有其自身弱点 ,如抗原必须达到较高纯 度 ,这样制备的抗体才具有广泛使用价值 。
用上述纯化 rhEPO 与福氏佐剂混合 ,免疫 6～8 周龄昆 明小鼠和 Bal b/ c 小鼠 ,免疫部位是背部皮下多点注射 ,每只 小鼠每次 15μg ,间隔 20 天 ,共免疫 4 次 ,第 5 次采用腹腔直接 注射抗原溶液加强免疫 ,免疫后 5 天于腹腔注射 S180 或 SP2/ 0 细胞 ,待腹腔膨胀 ,皮毛变得无光泽时 ,开始采集腹水 。 1. 4 抗体效价测定[3]
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生物技术通讯 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol. 12 No. 1 Feb. 2001
一种新的制备多克隆抗体的方法
邓瑞春1 张明伟2 白云秀2 汪劲松2 毛 宁2
(1军事医学科学院毒物药物研究所 ;2北京瑞得生物技术研究所 北京 100850)
摘要 用亲和色谱纯化的 rhEPO 作为抗原免疫 KM 小鼠和 Bal b/ c 小鼠 ,然后腹腔注射 S180 细胞或 SP2/ 0 细胞 。 S180 细胞可刺激 KM 小鼠产生腹水 ,腹水量大 ,抗体效价高 。而直接注射 SP2/ 0 细胞既未能使 KM 小鼠产生腹水 , 也未能使 Bal b/ c 小鼠产生腹水 。实验提供了一种新的简便 、快速 、经济地制备高效价多克隆抗体的方法 。 关键词 人纤维肉瘤细胞 ,小鼠骨髓瘤细胞 ,抗体
11
1 ×106
12
1 ×106
13
1 ×106
9
0. 5
17
12. 4
0. 7
10
0. 5
0. 4
21
10. 4
0. 5
12
15
0. 6
12
10
0. 4
14
9
1
14
4
0. 8 15 10 (死后采)
15
13
0. 5
15
5
0. 6
17
10
1
28
4
1
效 价 / ELISA
2. 56 ×105 1 ×106 1 ×106
在抗体亲和色谱纯化研究中 ,往往需制备大量抗体 ,否 则会严重影响该方法在大量纯化中的应用 ,尤其是对于那些 珍贵抗原 ,要想获得大量抗体就显得更加困难 。传统制备大 量抗体方法是免疫中大型动物获得多克隆抗体 ,但这种方法 常需较大量抗原 。另一种方法是制备单克隆抗体 ,但这种方 法生产周期长 ,且有些单克隆杂交细胞株分泌抗体很不稳 定 ,培养一段时间后 ,分泌抗体能力就丢失了 ,也限制了抗体 亲和色谱方法在大量纯化样品中的使用 。本文介绍一种能 制备大量抗体且抗原需求量又少的新方法 。
2 结果和讨论
2. 1 腹水及血清效价测定 结果见表 1 。腹腔直接注射 S180 细胞可以刺激 KM 小
鼠产生高效价抗体 ,这种高效价抗体既存在于腹水 ,也存在 于血清中 。由于 KM 小鼠个体较大 ,产生的腹水量较多 ,每
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采用间接 ELISA 法 ,用 rhEPO 细胞培养上清粗品包被 PVC 板 ,4 ℃过夜 ,用 3 %BSA ( PBST 配制) ,37 ℃封闭 1 h ,以 PBST 洗 3 次 ,加入梯度稀释的腹水 ,37 ℃1 h ,洗涤 3 次 ,加入 HRPΟ羊抗鼠 IgG 37 ℃1 h ,洗涤 3 次 ,加入 OPD 底物显色 ,室 温 20 min ,2 mol/ L H2SO4 终止反应 ,测定 492 nm 光吸收值 。
3 结论
利用人纤维肉瘤细胞可以在小鼠腹腔内迅速繁殖 ,并刺 激产生大量腹水的特性 ,用于制备鼠抗 rhEPO 抗体获得成 功 ,而且产生腹水的抗体效价高 ,腹水量大 ,为抗体制备提供 了一种新的快速 、简便的方法 。该方法使用抗原量少 ,动物 价格便宜 ,可以大大降低成本 。
由于我们使用了单克隆抗体亲和色谱柱纯化的 rhEPO 作为抗原 ,rhEPO 纯度达到 SDSΟPAGE 显示一条带的高纯度 , 针对该抗原产生的抗体会特异性地与 rhEPO 发生结合 ,而不 与其他杂质结合 ,这种抗体适合作为抗体亲和色谱柱的配 基 ,从而为制备较大的抗体亲和色谱柱提供了物质保障 。
采用 Hitrap Protein G Sepharose 亲和色谱柱对自制的抗 rhEPO McAb 2F12 进行纯化 ,获得高纯度的抗体 。将该抗体
与预活化的 Sepharose 4B 交联制 备 抗 体 亲 和 色 谱 柱 , 并 对 rhEPO 细胞培养上清进行纯化 ,获得在 SDSΟPAGE 上显示一 条带 (位于 30 000～39 000 之间) 的纯品 。 1. 3 动物免疫[2]
我们分别采用不同浓度的 S180 细胞来刺激 KM 鼠 ,随着 注射 S180 细胞量的增加 ,产生腹水速度加快 ,其中 1 ×106 产 生腹水时间较快 ,一般在 10～15 天之间 ,10 只鼠中只有两只 超过 15 天 。而注射 1 ×105 个 S180 细胞时 ,两只中有一只超 过 21 天 ,注射 2 ×105 个细胞时 ,两只中有一只超过 17 天 。 我们认为 1 ×106 细胞/ 只的量较适宜 。
Abstract The recombinant human erythropoietin(rhEPO) purified by affinity chromatography was used as antigen to immunize KM and Bal b/ c mice by abdominal cavity. After the fourth inoculation , human fibrosarcoma cell( S180) or mice myeloma cell (SP2/ 0) was injected into KM and Bal b/ c mice respectively via abdominal cavity , and immunize same antigen from abdominal cavity. It is found that the KM mice with S180 cell could produce ascites with high level antibody , but the KM mice with SP2/ 0 could not. Bal b/ c mice could not bear ascites nether with S180 nor with SP2/ 0. This method gives a simple and fast way to get a great quantity of polyclonal antibodies. Key words human fibrosarcoma , mice myeloma cell , antibody