植物抗虫基因工程
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Bt抗虫棉
鳞翅目
鞘翅目
双翅目
近年来人们在Ｂt毒蛋白基因的修饰与改 造、表达载体的构建、植物组织化等方面作 了大量的工作。
尽管Bt杀虫晶体蛋白的杀虫效果非常好， 但其杀虫谱较窄，对其敏感的主要是鳞翅目 和鞘翅目的一些害虫，如棉铃虫、玉米螟、 马铃薯甲虫等。
1.2 其他来源于微生物的抗虫基因 异戊烯基转移酶( ipt ) 是细胞分裂素合成中的
4.2 营养杀虫蛋白基因
营养杀虫蛋白是另一类高效杀虫蛋白质,它的敏感害虫 是另一种对B. t . 毒蛋白不敏感的重要农业害虫———鳞翅目 的地老虎。
这类蛋白可能与敏感昆虫表皮细胞,尤其是柱状细胞相结 合,造成细胞分解,伴随着肠道严重受损,受害昆虫迅速死亡。
三、抗虫基因工程的问题及展望
伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也
玉米田里的虫害
粘虫 （又称行军虫或剃秆虫 ）
为害症状
稻蓟马危 害状
（受害叶 叶尖枯黄， 甚至枯死）
水稻田里的虫害
稻蓟马成虫
植物抗虫基因工程的研究之所以能取得如此迅 猛的发展,主要是由于利用基因工程培育抗虫作物 新品种或新品系具有以下几个明显的优点:
(1)保护作用具有连续性,可控制植物整个生长期内害虫的危害;
4.1 胆固醇氧化酶基因
胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的一个关键酶。胆 固醇氧化酶的杀虫谱相当宽,对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅 目和同翅目的害虫都有不同程度的作用。它能氧化害虫生物膜 上的胆固醇,在较低浓度时,能使害虫的中肠纹缘膜受到破坏;在 较高浓度时,能发生完全的溶胞现象,从而膜的结构和功能都发 生变化以致引起害虫死亡,这一过程的生化机制目前还正在研究。
3 昆虫特异性神经毒素基因
昆虫神经激素是已知三大昆虫激素的一种, 它控 制着昆虫许多关键的生理过程, 影响昆虫的生长、 变态、生殖、代谢和行为等, 近年来, 人们已开始在 基因工程中利用昆虫神经激素防治害虫。目前, 蝎 毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素已被用于 植物抗虫基因工程。由于昆虫毒素专一作用于昆虫 而对于哺乳动物无害或毒性很小, 因此可开发作为 一种高效生物杀虫剂。
雪花莲
2.4 来源于高等植物的其他抗虫基因
几丁质酶(Chitinase) 是广泛存在于微生物和植物体内的一 类蛋白,1989 年Ary 等从Job草中分离得到一种几丁质酶,发现 它能抑制淀粉酶的活性,破坏昆虫肠上皮的保护层,导致消化道损 伤. 从而有效抑制蝗虫等昆虫类,但其在实际应用与理论相差较 大.烟草阴离子过氧化物酶基因在烟草、番茄中表达时,可产生对 鳞翅类,鞘翅类以及桃蚜的抗性,该酶作用是很复杂的,大部分人 认为其作用不是直接的,而主要是其产物的影响.
1 来源于微生物、细菌中的抗虫基因
1.1 B . t . 杀虫晶体蛋白基因
苏云金芽孢杆菌( Bacillus thuringiensis) 是一
种革蓝氏阳性土壤芽孢杆菌,在形成芽孢时,可产生杀 死昆虫幼虫的蛋白质,即通常所说的杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystal protein) 或δ- 内毒素(δ endotoxin) , 也称苏云金芽孢杆菌毒蛋白( B . t . toxic protein) 。它是目前世界上生产量最大的生 物农药杀虫剂,广泛用于防治农业、林业等方面的害 虫。
植物抗虫基因工程
熊恒硕
一、前言
虫害是造成农作物减产减收的主要原因之一。采用化学 和生物农药等手段防治固然可以减轻害虫对农作物的危害,但 这些方法不仅费用较高(每年耗费约10 亿美元) ,而且由于害虫 产生抗性等原因,防治效果欠佳。全球每年因虫害对农业生产 所造成的损失仍高达20 %～30 %。长期大量地施用农药除了 使害虫产生抗性外,还会带来一系列的社会问题,如人畜中毒事 故的发生、食物中农药的残留以及环境污染等。
①不易产生耐受性问题;
②抗虫谱广;
③其来源于植物易为公众所接受,并已证明 对人畜无副作用. 而且最近的研究资料表明,食用 天然的植物蛋白酶抑制剂具有抗肠癌的作用.
2.2 淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因分布也较广，以禾谷类作 物和豆科植物种子中的含量最为丰富，在植物对 病虫害侵染的天然防御系统中起着重要的作用 (Richardson，1997)。 这类酶抑制剂能抑制昆虫消化道内α －淀粉 酶活性，使食入的淀粉无法水解，阻断了昆虫主 要能量来源；并刺激昆虫过量分泌消化酶，通过 神经系统反馈产生厌食反应。
无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程首要 考虑的问题就是提高其表达量。一般来说，表达量 越高，抗虫效果就越好。导入的抗虫基因翻译水平 不高是普遍存在的问题，因此，如何提高外源抗虫 基因在植物体内的表达，是植物抗虫基因工程的一 个重要研究方向。
3 转抗虫基因植物潜在的生态风险性
转抗虫基因植物的安全性是一个长期、重要而且复杂的 问题，应谨慎对待。抗虫转基因植物的直接生态效应是对靶 标昆虫种群的控制，但靶标昆虫有无向其他寄主植物转移的 可能；害虫天敌种群会受到怎样的影响；次要害虫是否会变 为主要害虫；靠转基因作物的逃逸或从作物杂交中获取转基 因抗性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响都是需进 一步研究的问题。为了防止选择基因或报告基因的潜在风险， 目前，世界上已有许多实验室正在研究无标记转化系统。
通过常规育种技术和试管培养技术虽然已获得某些抗虫 害的作物品种。如野生型马铃薯( Solanum chacoense ) 和 栽培型马铃薯(S.tuberosum ) 的原生质体电融合获得的体细 胞杂合品系对一种马铃薯甲虫具有抗性。然而, 新品种的选育 需要较长的时间, 并且某些虫害尚无基因资源作为杂交的亲本。 所以, 用这种途径来获得抗虫作物是很困难的。
关键酶,来源于Agrobacterium tumefaciens (根瘤 土壤杆菌)的ipt 基因在烟草、番茄中表达后,可减少 烟草夜蛾对叶片的损伤,并降低桃蚜的生存力。然而, ipt 基因的表达对植物发育有负面影响,如使根系发育 不完全,降低叶绿素含量等。
蛋白酶抑制基因在抗虫植物基因工程中之 所以地位突出,是因为
B . t . 杀虫晶体蛋白是一类分子量为130～160kD 的蛋白质,在昆虫中肠碱性和还原性的环境下,被降解成 65～75 kD 的活性小肽,并和中肠纹缘膜上的受体结合。 现已证明受体为氨肽酶N 和钙粘着蛋白(cadherin) 类似 物。与受体结合的活性小肽插入到细胞膜上并形成穿孔, 使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡破坏,引起细胞肿 胀甚至裂解,从而导致昆虫瘫痪或死亡。
4 新杀虫基因的应用
传统抗虫基因主要是从人们熟知的具有杀虫能力的生物 中克隆出来的,如从苏云金芽孢杆菌中克隆B . t . 杀虫晶体蛋白 基因,而苏云金芽孢杆菌作为生物农药杀虫剂已在农业上应用 了几十年。新抗虫基因除了继续从这类已知具有杀虫能力的生 物中克隆外(如营养杀虫蛋白基因) ,还采用了普遍筛选的方法, 即用来作杀虫实验的样本可以是任意来源的植物组织、微生物 发酵液以及商品化的蛋白质等。采用对农业生产危害较大,但 又不好控制的害虫作为筛选实验对象。一旦出现杀虫效果明显 的实验即进行跟踪鉴定,确定杀虫物质是否为蛋白质。如果是 蛋白质,则根据此蛋白的功能、杀虫效率、杀虫的作用机理来 判断其作为新一代杀虫蛋白的潜在价值。第二代抗虫基因中的 胆固醇氧化酶基因就是以此方法发现并克隆的。
4 展望
植物抗虫基因工程在短短十几年中已取得了丰硕 成果，抗虫转基因棉花、玉米、马铃薯的商业化推 广证明了这项技术的实用性。另外，我们必须认识 到，基因工程并非是解决一切问题的万全之策，通 过植物基因工程得到的只是一种人工种质新材料， 而不是生产上可以立即应用的新品种，它必须经过 常规育种考验。只有将传统的抗虫育种、遗传工程 及田间综合防治相互结合起来，才能更好地控制害 虫发生，更好地改良植物。
此外,色氨酸脱羟酶( Tryptophan Decaiboxylase , TDC) , 核糖体灭活基因(Ribosome Inactive Protein ,RIP) . 豌豆脂肪 氧化酶(Pea lipoxygenase), 海藻糖酶抑制基因 ( Trehalosfatin) ,番茄素( Tomatime) ,多酚氧化酶( PPO) 和,脂 氧化酶(LOX) 都对昆虫有毒害作用.
(2) 对整个植株都有保护作用,包括化学杀虫剂很难接触的叶 下表面及根部等;
(3)对害虫毒性具有专一性;
(4) 可大大缩短育种周期,降低成本;
(5) 所表达出的杀虫蛋白存在于植物体内,不易被气候等环境 因素破坏，不存在环境污染;
(6)基因资源非常丰富 。目前全世界最常改良的性状中抗虫占 第二位(24%)。
ห้องสมุดไป่ตู้
2.3 植物凝集素基因
植物凝集素是一类糖结合蛋白,也是植物防御系统的一个组 成部分。第一个被描述具有抗虫作用的凝集素是菜豆凝集素 ( PHA) ,它实际上是一种α- 淀粉酶抑制剂。1993 年英国科学 工作者从雪花莲中克隆出雪花莲凝集素基因( GNA) ,对稻飞虱、 叶蝉、蚜虫等有毒性作用。现在GNA 基因已作为一种抗虫基 因转化其他作物。我国黄大昉等(1997) 也报道来源于掌叶半 夏和半夏的凝集素对麦管蚜、棉蚜、桃蚜等有致死作用。 目前成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有: 雪花莲凝集 素( GNA) 基因、豌豆凝集素( P -Lec) 基因、麦胚凝集素 ( WGA) 基因及半夏凝集素(PTA) 基因。
谢谢大家！ 敬请批评指正！
二、抗虫基因
人们已从微生物细菌中、植物本身以及昆虫体 内发现并分离到许多抗虫基因，有许多抗虫转基因 植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。 迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基因主要有两 类:一类是从微生物、细菌中分离出来的抗虫基因， 如苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt基因)、异戊烯基转移 酶基因(ipt)，另一类是从植物中分离出来的抗虫基 因，如蛋白酶抑制剂基因(PI基因)、淀粉酶抑制剂 基因、外源凝集素基因等。其中Bt基因和PI基因在 农业上利用最广。此外，昆虫特异性神经毒素基因 等也在研究当中。
日益显露。
1 抗虫转基因工程中昆虫的抗性问题
害虫的抗性是指一个种群在遗传基础上降低了对某一种杀 虫剂的敏感性。
目前较常采用的方法有： (1)使用组织特异性表达启动子和损伤诱导启动子等特殊的 启动子； (2)采取2个或2个以上不同杀虫机理的抗虫基因同时转入植 物中； (3)提供“避难所” 等。
2 “基因沉默”现象
鳞翅目
鞘翅目
双翅目
近年来人们在Ｂt毒蛋白基因的修饰与改 造、表达载体的构建、植物组织化等方面作 了大量的工作。
尽管Bt杀虫晶体蛋白的杀虫效果非常好， 但其杀虫谱较窄，对其敏感的主要是鳞翅目 和鞘翅目的一些害虫，如棉铃虫、玉米螟、 马铃薯甲虫等。
1.2 其他来源于微生物的抗虫基因 异戊烯基转移酶( ipt ) 是细胞分裂素合成中的
4.2 营养杀虫蛋白基因
营养杀虫蛋白是另一类高效杀虫蛋白质,它的敏感害虫 是另一种对B. t . 毒蛋白不敏感的重要农业害虫———鳞翅目 的地老虎。
这类蛋白可能与敏感昆虫表皮细胞,尤其是柱状细胞相结 合,造成细胞分解,伴随着肠道严重受损,受害昆虫迅速死亡。
三、抗虫基因工程的问题及展望
伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也
玉米田里的虫害
粘虫 （又称行军虫或剃秆虫 ）
为害症状
稻蓟马危 害状
（受害叶 叶尖枯黄， 甚至枯死）
水稻田里的虫害
稻蓟马成虫
植物抗虫基因工程的研究之所以能取得如此迅 猛的发展,主要是由于利用基因工程培育抗虫作物 新品种或新品系具有以下几个明显的优点:
(1)保护作用具有连续性,可控制植物整个生长期内害虫的危害;
4.1 胆固醇氧化酶基因
胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的一个关键酶。胆 固醇氧化酶的杀虫谱相当宽,对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅 目和同翅目的害虫都有不同程度的作用。它能氧化害虫生物膜 上的胆固醇,在较低浓度时,能使害虫的中肠纹缘膜受到破坏;在 较高浓度时,能发生完全的溶胞现象,从而膜的结构和功能都发 生变化以致引起害虫死亡,这一过程的生化机制目前还正在研究。
3 昆虫特异性神经毒素基因
昆虫神经激素是已知三大昆虫激素的一种, 它控 制着昆虫许多关键的生理过程, 影响昆虫的生长、 变态、生殖、代谢和行为等, 近年来, 人们已开始在 基因工程中利用昆虫神经激素防治害虫。目前, 蝎 毒素和蜘蛛毒素两种昆虫特异性神经毒素已被用于 植物抗虫基因工程。由于昆虫毒素专一作用于昆虫 而对于哺乳动物无害或毒性很小, 因此可开发作为 一种高效生物杀虫剂。
雪花莲
2.4 来源于高等植物的其他抗虫基因
几丁质酶(Chitinase) 是广泛存在于微生物和植物体内的一 类蛋白,1989 年Ary 等从Job草中分离得到一种几丁质酶,发现 它能抑制淀粉酶的活性,破坏昆虫肠上皮的保护层,导致消化道损 伤. 从而有效抑制蝗虫等昆虫类,但其在实际应用与理论相差较 大.烟草阴离子过氧化物酶基因在烟草、番茄中表达时,可产生对 鳞翅类,鞘翅类以及桃蚜的抗性,该酶作用是很复杂的,大部分人 认为其作用不是直接的,而主要是其产物的影响.
1 来源于微生物、细菌中的抗虫基因
1.1 B . t . 杀虫晶体蛋白基因
苏云金芽孢杆菌( Bacillus thuringiensis) 是一
种革蓝氏阳性土壤芽孢杆菌,在形成芽孢时,可产生杀 死昆虫幼虫的蛋白质,即通常所说的杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystal protein) 或δ- 内毒素(δ endotoxin) , 也称苏云金芽孢杆菌毒蛋白( B . t . toxic protein) 。它是目前世界上生产量最大的生 物农药杀虫剂,广泛用于防治农业、林业等方面的害 虫。
植物抗虫基因工程
熊恒硕
一、前言
虫害是造成农作物减产减收的主要原因之一。采用化学 和生物农药等手段防治固然可以减轻害虫对农作物的危害,但 这些方法不仅费用较高(每年耗费约10 亿美元) ,而且由于害虫 产生抗性等原因,防治效果欠佳。全球每年因虫害对农业生产 所造成的损失仍高达20 %～30 %。长期大量地施用农药除了 使害虫产生抗性外,还会带来一系列的社会问题,如人畜中毒事 故的发生、食物中农药的残留以及环境污染等。
①不易产生耐受性问题;
②抗虫谱广;
③其来源于植物易为公众所接受,并已证明 对人畜无副作用. 而且最近的研究资料表明,食用 天然的植物蛋白酶抑制剂具有抗肠癌的作用.
2.2 淀粉酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因分布也较广，以禾谷类作 物和豆科植物种子中的含量最为丰富，在植物对 病虫害侵染的天然防御系统中起着重要的作用 (Richardson，1997)。 这类酶抑制剂能抑制昆虫消化道内α －淀粉 酶活性，使食入的淀粉无法水解，阻断了昆虫主 要能量来源；并刺激昆虫过量分泌消化酶，通过 神经系统反馈产生厌食反应。
无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程首要 考虑的问题就是提高其表达量。一般来说，表达量 越高，抗虫效果就越好。导入的抗虫基因翻译水平 不高是普遍存在的问题，因此，如何提高外源抗虫 基因在植物体内的表达，是植物抗虫基因工程的一 个重要研究方向。
3 转抗虫基因植物潜在的生态风险性
转抗虫基因植物的安全性是一个长期、重要而且复杂的 问题，应谨慎对待。抗虫转基因植物的直接生态效应是对靶 标昆虫种群的控制，但靶标昆虫有无向其他寄主植物转移的 可能；害虫天敌种群会受到怎样的影响；次要害虫是否会变 为主要害虫；靠转基因作物的逃逸或从作物杂交中获取转基 因抗性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响都是需进 一步研究的问题。为了防止选择基因或报告基因的潜在风险， 目前，世界上已有许多实验室正在研究无标记转化系统。
通过常规育种技术和试管培养技术虽然已获得某些抗虫 害的作物品种。如野生型马铃薯( Solanum chacoense ) 和 栽培型马铃薯(S.tuberosum ) 的原生质体电融合获得的体细 胞杂合品系对一种马铃薯甲虫具有抗性。然而, 新品种的选育 需要较长的时间, 并且某些虫害尚无基因资源作为杂交的亲本。 所以, 用这种途径来获得抗虫作物是很困难的。
关键酶,来源于Agrobacterium tumefaciens (根瘤 土壤杆菌)的ipt 基因在烟草、番茄中表达后,可减少 烟草夜蛾对叶片的损伤,并降低桃蚜的生存力。然而, ipt 基因的表达对植物发育有负面影响,如使根系发育 不完全,降低叶绿素含量等。
蛋白酶抑制基因在抗虫植物基因工程中之 所以地位突出,是因为
B . t . 杀虫晶体蛋白是一类分子量为130～160kD 的蛋白质,在昆虫中肠碱性和还原性的环境下,被降解成 65～75 kD 的活性小肽,并和中肠纹缘膜上的受体结合。 现已证明受体为氨肽酶N 和钙粘着蛋白(cadherin) 类似 物。与受体结合的活性小肽插入到细胞膜上并形成穿孔, 使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡破坏,引起细胞肿 胀甚至裂解,从而导致昆虫瘫痪或死亡。
4 新杀虫基因的应用
传统抗虫基因主要是从人们熟知的具有杀虫能力的生物 中克隆出来的,如从苏云金芽孢杆菌中克隆B . t . 杀虫晶体蛋白 基因,而苏云金芽孢杆菌作为生物农药杀虫剂已在农业上应用 了几十年。新抗虫基因除了继续从这类已知具有杀虫能力的生 物中克隆外(如营养杀虫蛋白基因) ,还采用了普遍筛选的方法, 即用来作杀虫实验的样本可以是任意来源的植物组织、微生物 发酵液以及商品化的蛋白质等。采用对农业生产危害较大,但 又不好控制的害虫作为筛选实验对象。一旦出现杀虫效果明显 的实验即进行跟踪鉴定,确定杀虫物质是否为蛋白质。如果是 蛋白质,则根据此蛋白的功能、杀虫效率、杀虫的作用机理来 判断其作为新一代杀虫蛋白的潜在价值。第二代抗虫基因中的 胆固醇氧化酶基因就是以此方法发现并克隆的。
4 展望
植物抗虫基因工程在短短十几年中已取得了丰硕 成果，抗虫转基因棉花、玉米、马铃薯的商业化推 广证明了这项技术的实用性。另外，我们必须认识 到，基因工程并非是解决一切问题的万全之策，通 过植物基因工程得到的只是一种人工种质新材料， 而不是生产上可以立即应用的新品种，它必须经过 常规育种考验。只有将传统的抗虫育种、遗传工程 及田间综合防治相互结合起来，才能更好地控制害 虫发生，更好地改良植物。
此外,色氨酸脱羟酶( Tryptophan Decaiboxylase , TDC) , 核糖体灭活基因(Ribosome Inactive Protein ,RIP) . 豌豆脂肪 氧化酶(Pea lipoxygenase), 海藻糖酶抑制基因 ( Trehalosfatin) ,番茄素( Tomatime) ,多酚氧化酶( PPO) 和,脂 氧化酶(LOX) 都对昆虫有毒害作用.
(2) 对整个植株都有保护作用,包括化学杀虫剂很难接触的叶 下表面及根部等;
(3)对害虫毒性具有专一性;
(4) 可大大缩短育种周期,降低成本;
(5) 所表达出的杀虫蛋白存在于植物体内,不易被气候等环境 因素破坏，不存在环境污染;
(6)基因资源非常丰富 。目前全世界最常改良的性状中抗虫占 第二位(24%)。
ห้องสมุดไป่ตู้
2.3 植物凝集素基因
植物凝集素是一类糖结合蛋白,也是植物防御系统的一个组 成部分。第一个被描述具有抗虫作用的凝集素是菜豆凝集素 ( PHA) ,它实际上是一种α- 淀粉酶抑制剂。1993 年英国科学 工作者从雪花莲中克隆出雪花莲凝集素基因( GNA) ,对稻飞虱、 叶蝉、蚜虫等有毒性作用。现在GNA 基因已作为一种抗虫基 因转化其他作物。我国黄大昉等(1997) 也报道来源于掌叶半 夏和半夏的凝集素对麦管蚜、棉蚜、桃蚜等有致死作用。 目前成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有: 雪花莲凝集 素( GNA) 基因、豌豆凝集素( P -Lec) 基因、麦胚凝集素 ( WGA) 基因及半夏凝集素(PTA) 基因。
谢谢大家！ 敬请批评指正！
二、抗虫基因
人们已从微生物细菌中、植物本身以及昆虫体 内发现并分离到许多抗虫基因，有许多抗虫转基因 植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。 迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基因主要有两 类:一类是从微生物、细菌中分离出来的抗虫基因， 如苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt基因)、异戊烯基转移 酶基因(ipt)，另一类是从植物中分离出来的抗虫基 因，如蛋白酶抑制剂基因(PI基因)、淀粉酶抑制剂 基因、外源凝集素基因等。其中Bt基因和PI基因在 农业上利用最广。此外，昆虫特异性神经毒素基因 等也在研究当中。
日益显露。
1 抗虫转基因工程中昆虫的抗性问题
害虫的抗性是指一个种群在遗传基础上降低了对某一种杀 虫剂的敏感性。
目前较常采用的方法有： (1)使用组织特异性表达启动子和损伤诱导启动子等特殊的 启动子； (2)采取2个或2个以上不同杀虫机理的抗虫基因同时转入植 物中； (3)提供“避难所” 等。
2 “基因沉默”现象