03第三章 生物制品的菌种与毒种(兽医生物制品学)

(四)遗传性状稳定
菌种和毒种在保存、传代和使用过程中，受各种因素影响而变异， 因此保证其遗传性状稳定是保证生物制品质量的重要因素之一。
微生物种是以群体形式存在，遗传学纯一性和相对稳定性是指群体变异幅度 必须有严格的限制。为保持种的纯一和相对稳定，生产生物制品的菌、毒种应通 过定期传代、筛选、检定等工作进行控制。
初选依据包括: ①细菌菌落特征变异，如菌落大小、形状，色泽、粗糙或 光滑称荧光等；②病毒蚀斑的变异；③对温度敏感性变异；④对药物敏感性变 异；⑤对营养要求变异，如对氨基酸的特殊需要；⑥对宿主动物易感性变异。 我国经过长期研究，育成了一些弱毒株作为疫苗种毒生产疫苗，在控制和消灭 动物疫病中发挥了重要作用。
例如，鸡新城疫出LaSota弱毒株和D10，是分别从自然鸡群和鸭群中分离 到的，然后再通过克隆、挑选等途径育成。鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒FC126株 即分离于火鸡，对鸡无致病性，其抗原性与鸡马立克氏病病毒一致。然而，微 生物自发突变率往往很低，形成具有稳定遗传性状的过程比较长，因此获得的 机率不高。
2.弱毒菌种和毒种的选育途径
弱毒菌（毒）种的选育
自然弱毒株的分离
人工诱变致弱
同源动物 (如NDV LaSota株)
异源动物 (如HVT FC126株)
化学途径
物理途径
生物途径
亚硝基胍 醋酸铊 洗衣粉
高温 紫外线
非易感动物 鸡胚、细胞
杂交减毒
1.自然弱毒株的选育
自然弱毒株又称自发突变毒株，由自然强毒株在自然因素作用下因 遗传基因突变形成了与祖代性状(特别是致病力和抗原性)不尽相同的生 物株。这些自然因素，如异种非易感动物、温度、日光、干燥、紫外线 等都可能是导致细菌和病毒自发突变的原因。因此，人们往往有意或无 意地从自然中分离、筛选和育成一些弱毒菌(毒)株，作为兽医生物制品 的种毒。
(3)通过生物途径选育
通过生物途径育成的弱毒株，其生物稳定性极佳，但育成过程比较长。迄 今为止，大部分活疫苗的菌种和毒种是由该途径选育而成。常用育成路线有:
1)适应非易感动物 (非自然宿主) 通常用兔、小鼠、地鼠、豚鼠、鸡等实验动物，其优点是动物来源广、饲
养管理方便、成本低及操作简便。多采取大剂量腹腔、静脉或脑内接种。如我 国的猪瘟兔化弱毒株，是将猪瘟病毒强毒株通过兔体传400余代后育成的；鸭瘟 鸡胚化弱毒株则是将强毒株通过鸭胚9代和鸡胚23代后培育而成。
菌（毒）种是国家的重要生物资源，现在世界各国对这项资 源都极为重视，并设置各种专业性的保藏机构，现在不少国家的 菌种与毒种中心都用电子计算机进行管理，在欧洲甚主准备对国 家问的菌种中心用电子计算机联网。
(二)菌、毒种的分类Fra bibliotek生物制品用的菌种和毒种，按其在生物制品生产、检定 过程中用途的不同，可分为四类：
马流产弱毒菌株 (C355) 强毒株→含醋酸钝培养基传代
禽霍乱弱毒菌株 (G190E40) 强毒株→豚鼠190代→鸡胚传代
布鲁氏菌羊5号弱毒菌株 布氏羊型强毒株→鸡胚传代
猪瘟兔化弱毒株
强毒株→免传代
马传贫驴白细胞弱毒株 马传贫驴强毒株→驴白细胞传代
鸡痘弱毒株
强毒株→鸽鸦传代
口蹄疫0型鼠化弱毒株 牛源强毒株→乳鼠传代
(二)弱毒菌种和毒种的选育
1.弱毒菌种和毒种
用途：弱毒菌种和毒种主要用于弱毒活疫苗、部分诊断制品以 及抗血清的制造。 特性：致病力极微弱或无致病力，免疫原性优良，能使免疫动 物获得坚强的免疫力。 来源：从自然界筛选，或以人工改变野生型强毒株的遗传特性 进行培育获得。
无论自然弱毒株或人工培育弱毒株，均是由微生物基因核 苷酸碱基的改变，而导致遗传性状突变及毒力降低的结果。
以上这些途径，既可单独使用，也可交叉联合使用。
(1)通过化学途径选
微生物在体外培养传代过程中，经诱变剂处理，可极大地提高其基因突变 率，从而获得弱毒菌株或毒株。例如，用亚硝酸基胍处理支原体育成了鸡支原 体疫苗株；猪副伤寒沙门氏菌强毒株则在含有1/500～1/4000醋酸铊的肉汤培养 基中培养传代50代次，培育成弱毒株用于制造疫苗。
3．稳定性测定
对适应于培养基、鸡胚或易感细胞上增值培养和传代的菌株或毒 株的毒力（致病力）和抗原性还要进行稳定性测定，以证明其后代特 性不变，才有使用价值，并参与筛选择优。
4．综合判定，冻干保存
根据致病力、抗原性和稳定性测定结果，筛选出毒力强、形状稳 定的菌株或毒株，经增值后进行冻干保存。冻干后菌种于4C°保存， 冻干的病毒种保存于-20°以下，可保存多年。通常经鉴定的菌株或 毒种批，按需分装后冻干保存，可使用多年。冻干菌株或毒种一经动 物传代，即应重新分离、鉴定和检测后方能供种子或种毒用。
制造灭活苗的菌种和毒株，应该是标准强毒或者弱毒，以免疫原性优良为 基本条件，必须经过严格的审查与鉴定，要求一切性状必须典型。如《规程》 规定，制造猪丹毒灭活苗，必须选择典型光滑型、圆形、露珠状的小菌落。制 造弱毒苗的毒种与菌种，毒力必须稳定，形态特征典型，不易变异，特别应注 意其与强毒株生物学性状区别的要点。
我国兽医生物制品菌种和毒种管理3种情况：①中国兽药监察所（中监所） 鉴定和保管；②委托有关单位代管，如委托哈尔滨兽医研究所管理的猪丹毒GC42 菌苗株、黑龙江省生物制品一厂代管的禽霍乱G190E140菌苗株等；③各地菌种， 由中监所统一鉴定，如大肠杆菌。
(二)生物学特性比较典型
生物学特性包括菌种和毒的形态特征、培养特性(菌落特征、蚀斑特 征)：对动物的病原性特点及引起细胞病变的特征；生物化学、免疫学及 血清学特性等等，均应符合标准。
不同菌株或毒株间基因发生交换而育成有使用价值的弱毒株。如流行性感冒弱 毒株的育成，是将温度敏感弱毒株(抗原性较低)与流行强毒株进行混合培养传 代，便两者毒力基因发生交换，其后代即成为毒力低和抗原性强的毒株，再用 于制造弱毒疫苗。
由于微生物变异的方向难以预测，所以只能在培育过程中对各个表现遗传 性状的群体按照需要进行选择，以求筛选出目的变异株。这种选择首先从外表 观察和检查开始；然后再作系统的检测筛选。
第二章
生物制品的菌种与毒种
主要内容： 一、菌种、毒种的概念与分类 二、菌种、毒种的一般要求 三、菌种、毒种的选育
一、生物制品菌种和毒种的概念与分类
(一)概念
凡应用于生物制品(疫苗、免疫血清及诊断制剂等)生产、检 定和研究的细菌、病毒的原种，以及分类地位上在原虫以下的生 物种均属生物制品的菌种与毒种范围。其中主要指生物制品生产， 检定用的菌种与毒种。有人建议,将制苗用的细胞株(二倍体细胞 株、传代细胞系等)纳入菌种与毒种的管理范围。
(一)来源(历史)清楚，资料完整
由专门机关保管、分发的生物制品用菌种和毒种，对其来源、分离和 传代的历史、生物学特性以及免疫学特性、安全与效力检定等资料，有 关审批单位的鉴定，结论及审核批示材料均应清楚。
《兽医生物制品制造规程》规定，凡经农业部发给批准文号的产品， 生产所需的菌种和毒种，由中监所或中监所委托分管的单位负责供应。
表3-1 我国一些弱毒株的育成线路与方法
弱毒株
致弱线路与方法
猪丹毒弱毒菌株 (GC42) 强毒株→豚鼠370代→鸡42代
猪丹毒弱毒菌株 (G4T10) 强毒株→豚鼠370代→含有0.01%～0.04%吖啶 黄血液琼脂培养基上传10代
猪肺疫弱毒菌株 (EO630) 强毒株→含海鸥牌洗衣粉培养基上传630代
鸭瘟弱毒株
强毒株→鸭胚传代→鸡胚传代
牛肺疫免化弱毒株
牛肺疫强毒株→兔传代
四、对生产与检验用菌(毒、虫)种要求
1.生产用菌(毒、虫)种来源和特性 原种的代号、来源、历史(包括分离、鉴定、选育或构建过程等)，
感染滴度，血清学特性或特异性，细菌的形态、培养特性、生化特性， 病毒对细胞的适应性等资料要清楚。
2)适应细胞 通常多采用同源或异源动物组织的原代细胞，或者是一种细胞，或者用2种
细胞。日本育成的猪瘟GPE弱毒株是将猪瘟ALD强毒株通过猪睾丸细胞142代和牛 睾丸细胞36代后，再在豚鼠肾细胞传41代后育成的。我国的马传染性贫血驴白 细胞弱毒株，是将马传贫驴强毒株通过驴白细胞传代育成的。
3)杂交减毒 将两种遗传性状不同的菌株或毒株，在传代培育中进行自然杂交，以导致
1.生产用的菌种和毒种 2.工具菌种和毒种
① 直接生产用的菌和毒种 ② 免疫用的菌和毒种 ③ 加工用的菌和毒种
3.检定用的菌种和毒种
4.标准菌株/毒株以及参考菌株/毒株
二、生物制品菌种和毒种的一般要求
菌种和毒种是生物制品质量的关键因素之一。制备疫苗、免疫血清 必须安全、有效；诊断制剂必须特异而敏感。
(2)通过物理途径选育
热和干燥等物理因素可干扰DNA的复制，从而引起突变，导致遗传性状的 改变。1881年巴斯德将炭疽强毒菌株在42.5℃高温下长期传代培养，导致了遗 传性状变异，从而育成了炭疽弱毒菌株作为制造用菌种；1885年又将含有狂犬 病病毒的脑脊髓置于干燥条件中处理，制成弱毒疫苗。日本乙型脑炎病毒强毒 株则经紫外线照射后引起突变，从而出现遗传性状分离，再进行蚀斑挑选，育 成了弱毒株。
生产用的病毒毒种是否具有同质性，直接关系到生物制品的质量。我国用于 生产畜禽用活疫苗的病毒毒种，一类是我国自行分离培育的弱毒株；另一类是从 国外引进的。二者大部分都未进行过纯化和标准化，均属于群体(多克隆)病毒， 病毒粒于的大小与构造、增殖速度、蚀斑形成能力。
三、菌种和毒种选育
(一)强毒力菌种和毒种选育
2.经典方法诱发突变弱毒株的选育
原理和方法： ➢ 某些化学药物可引起微生物基因核苷酸碱基发生改变，从而使该 微生物遗传性状产生变化，这类物质为诱变剂。 ➢ 物理因素也能引起微生物突变，使其代谢类型发生变化，从而获 得遗传性状不同于祖代的毒株。 ➢ 异种非易感动物能使强迫进入的微生物经传代诱变、适应而发生 遗传性状不同于祖代的突变，也能育成弱毒株。 ➢ 此外，也可通过细胞或禽胚等传代发生突变而育成弱毒株。
1．毒力鉴定
常用易感实验动物、本动物、鸡胚或易感细胞测定分离菌株和毒 株MLD(最小致死量)、LD50(半数致死量)、CELD50(鸡胚半数致死量)、 CEID50(鸡胚半数感染量)或TCID50(细胞半数感染量)
2．免疫原性测定
菌株和毒株的抗原性包括：抗原与抗体结合发生特异性反应的反 应原性和刺激机体产生抗体及致敏淋巴细胞的免疫原性。反应原性多 采用血清学方法测定，以抗体滴度或效价表示；免疫原性多采用对免 疫动物用定量原强毒菌株和毒株攻击测定保护效力。无论致病力测定 或抗原测定，均应设阴阳性对照，否则无效。
病毒或细菌分离
()
纯粹性试验
一
致病力试验
抗原性试验
强 毒
原动物 实验 鸡胚 细胞
抗原性 免疫原性
力
动物
菌
种
LD50 ELD50 EID50 TICD50 血清学 攻毒保护
和
试验
试验
毒 种
稳定性试验
选
育 筛选出毒力强，生长稳定、纯净的毒株，用于制备疫苗、诊断液
和治疗用抗体活用于疫苗效力检验等
冻干、冷冻或冷藏保存
强毒菌种和毒种广泛用于诊断制品、抗病血清、灭活疫苗和疫苗制 品的效力检验。用作人工培育弱毒的原始毒种，并用于微生物学、免疫 学及传染病学等研究。
强毒菌种和毒种常自疾病流行地区的典型患病动物体内分离。在疾 病流行初期，从临床症状和病理变化典型而又未经任何治疗的患病动物 体分离到毒力强和抗原性良好的自然强菌株和毒株，如我国的石门系猪 瘟病毒和多杀性巴氏杆菌C44-1等。然后，用从各地分离的自然强菌株和 毒株中筛选出符合标准的菌株和毒株，供生物制品的制造和检验。
生物制品主要是用于预防、治疗和诊断畜禽等传染性疾病的免疫制剂，因 此要求生物制品生产用的菌种和毒种必须具有良好的抗原性和免疫原性。
对制备活疫苗的菌种和毒种，必须严格筛选、严格检验。特别应注意其安 全性，包括菌种和毒种本身及外源性污染两个方面。
(三)血清型相符
在菌种和毒种选择与鉴定时，需特别注意菌种和毒种特性与血清型 与疫苗使用地区流行的病原相符。
2.生产用菌(毒、虫)种种子批 生产用菌(毒、虫)种原始种子批、基础种子批建立要有相关的资料，
包括各种子批的传代方法、数量、代次、制备、保存方法。
3.生产用菌(毒、虫)种基础种子的全面鉴定
对生产用菌(毒、虫)种的基础种子，要有全面的鉴定，包括外源因子 检测、鉴别检验、感染滴度、免疫原性、血清学特性或特异性、纯粹或 纯净性、毒力稳定性、安全性、免疫抑制特性等。