第三章 蛋白质的修饰和表达

修饰机制：选择性的试剂或者亲和标记试剂与 侧链上的特定功能团发生化学反应 修饰类型：巯基、氨基、羧基、二硫键
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（一）巯基的修饰
特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团 修饰试剂 烷基化试剂 （碘乙酸、碘乙酰胺） N-乙基马来酰亚胺 DTNB 反应类型 羧甲基化 光吸收 二硫键、 有颜色的TNB
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（二、氨基的化学修饰）
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四、蛋白质的化学交联和化学偶联
• 交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。 • 偶联：蛋白质分子偶联到一个化学惰性的 水不溶性的载体上。
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蛋白质的化学交联
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蛋白质的化学交联
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蛋白质分子固定示意图
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第二节 蛋白质的分子生物学改造
• 基因突变 定点突变 定向进化 • 基因融合
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一、目标蛋白质在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌表达体系优越性：
1、对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的 分子机理有深刻的了解； 2、是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用 的寄主菌株和不同类型的载体； 3、许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实 现有效、高水平的表达； 4、大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用 于批量生产。
第三章
第一节
蛋白质的修饰和表达
蛋白质修饰的化ຫໍສະໝຸດ Baidu途径
第二节
第三节
蛋白质改造的分子生物学途径
重组蛋白质的表达
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第一节
蛋白质的化学修饰
一、蛋白质侧链基团的化学修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 四、蛋白质的化学交联和化学偶联
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一、蛋白质侧链基团的化学修饰
修饰部位：蛋白质的侧链基团
细胞外周质表达
周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于 内膜和外膜之间的细胞结构部分。 特点：在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列 才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。
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细胞外周质表达
优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白 质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧 化环境） 4. 蛋白质的N－末端结构真实 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内 对信号肽进行切割 缺点： 1. 信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2. 有可能形成包涵体
原核表达体系：大肠杆菌
表达载体(expression vector) 真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物 为使插入的外源DNA序列可转录和翻 译成多肽链而特意设计的载体称为表达 载体。
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常见的克隆载体：
• • • • • 质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等克隆载体(cloning vector)
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（四）二硫键的化学修饰
• 修饰方法：还原
• 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 • 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是 链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE 电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形
成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形
成二硫键。
特点：亲和反应活性高 赖氨酸的ε –氨基 修饰试剂 反应类型 TNBS 黄色复合物（420nm） 烷基化试剂 （卤代乙酸、芳基卤、芳族磺酸） 磷酸吡哆醛 光吸收
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（三）羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性质使蛋白质 分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很 有限，产物一般是酯类或酰胺类。
• 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团， 最广泛，可在较温和的条件进行
的信号肽之后； 在目的基因的两端分别加上不同的亲和标签； 将目标基因插入到信号肽序列和插入序列之间
2、影响基因融合的因素：
融合蛋白接头的设计和选择 构建融合蛋白的常用技术
3、 主要应用
问题？
利用其生物学功能 利用其与受体结合的特异性，构建导向药物
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第三节 重组蛋白质的表达
克隆载体(cloning vector) 依据其宿主细胞的不同可分为: 为使插入的外源DNA序列被扩增而特 意设计的载体称为克隆载体。
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3. 转录终止序列有助于外源基因的高效表达
尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋 白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中 都带有转录终止序列。 转录终止序列长短不一，短的只有几十bp，长的可达 几百bp。 转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆的外 源基因，控制所转录RNA的长度，提高RNA稳定性。 位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的
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2、转录终止区对外源基因表达效率产生影响 3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率 的影响 4、密码子偏好性
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5、表达定位 根据外源蛋白在细胞内外的位置分为：
胞内 胞质膜 胞周质 外膜 胞外培养基
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表达的外源蛋白定位在胞内 优点：
1、形成包涵体 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害 2、蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致 外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。 3、表达的质粒载体构建比较简单。
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（二）在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素
1、启动子结构对表达效率的影响 能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白 的10%-30%以上。 呈现低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质 或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用 高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。 诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而 得以诱导。
4、许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细 胞中并不存在；
5、细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质 分子，并把它们降解掉。
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（一）表达载体的构建（组成） 1、复制的起始点 2、选择性基因 3、启动子 4、核糖体结合位点 5、多克隆位点 6、转录终止序列
通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可
防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。
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无启动子的CAT质粒载体
Ecoli DNA
CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发生乙酰化作用。
构建Ecoli基因文库
利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定 薄层层析
放射自显影
细胞裂解物、 14C标记得氯霉素 乙酰辅酶A
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α-互补（蓝-白筛选）
MCS无插入片段
Lac Z基因 MCS
MCS有插入片段
β-半乳糖苷酶 X-Gal 蓝色
载体上有β-半乳糖苷酶N端编码序列， 细菌染色体 DNA有β-半乳糖苷酶C端编码序列
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常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体
核苷酸片段
重组质粒
筛选
表达
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酶切割 同时获得多个突变体
蛋白基因
盒 式 突 变
新突变质粒 核苷酸片段
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（二）定向进化（directed evolution）
• 范围：特定的蛋白质 • 条件：大量突变体、合适的筛选系统
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1、制造突变体
方法：易错PCR、DNA改组技术
易错PCR原理： 改变正常PCR反应体系 中某些组分的数量或者 质量，随即引入错误碱 基创造序列多样性的 DNA文库。 难点：适当的突变频率 DNA改组技术原理： 靶基因酶切产生随机DNA 片段，以3’-末端的片端为 引物和模板，随机互补结 合并延伸。 优点：突变率高、 适用不同物种
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质粒
外源DNA
限制性内切酶
限制性内切酶
一、目的基因的获得
退火
目的基因
受体细胞
转化
二、重组
五、外源基因在受体细胞内表达 重组质粒
筛选 四、筛选和鉴定接受了重组体的细胞 三、重组体转入受体细胞 表达
带重组体的细胞
目的产物
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（一）定点突变
• 定义：改变一个或两个碱基
• 特点：突变率高、简单易行、重复性好
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表达的外源蛋白定位在胞内 缺点：
1、包涵体 a 蛋白质发生折叠，再折叠的蛋白质可能无法恢复 其生物学活性 b 蛋白质的终产量偏低 c 蛋白质的生产成本比较昂贵 2、还原的环境不利于二硫键的形成 （硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统） 3、由于N－末端存在甲硫氨酸，影响蛋白质的真实性 4、 蛋白质会被酶解 5、蛋白质种类多，因此纯化比较复杂 47
R：调节序列；P：启动子； SD：SD序列；TT：转录终止序列
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1. 启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被RNA聚合
酶所识别：目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种
Lac启动子（乳糖启动子） Trp启动子（色氨酸启动子） Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和PR启动子（λ噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子
二、基因的融合
• 概念：不同的基因或者基因片段序列构成一 个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后， 获得由不同功能蛋白拼合在一起的新型多功 能蛋白。 • 原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删 除，接上带有终止密码子的第二个蛋白或者 多肽基因，实现两个基因的融合表达
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基因融合的策略
1、方法
将融合基因通过合适的酶切位点直接剪切到适当
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2、筛选
方法：表型观察选择、高通量筛选 （1）噬菌体表面展示技术 概念：外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合存于噬菌体表面的技术 特点：基因型和表型统一在同一病毒颗粒内
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噬 菌 体 展 示 技 术 的 基 本 原 理
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（2）核糖体展示技术 原理：
该技术是基于一种稳定的抗体-核糖体-mRNA复合物的构象基 础。抗体蛋白与它的编码序列物理连接。抗体基因转录，产生 许多mRNA分子，每一个代表着不同抗体基因。mRNA分子与 细菌的核糖体孵育，然后mRNA翻译成蛋白质。每个复合体展 示一种不同的抗体，当经过一个含有靶标抗原的亲和柱子后， 一些能结合上去的复合体不会被洗去，该展示技术完全在体外 完成，并且不需要克隆就能完成大规模抗体库的构建。 28
2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
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组成：
Trp启动子的表达载体
1、大肠杆菌染色体DNA的5.4kb Hind 片断， 含有trp启 动子、操纵单元、前导序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基 因的部分序列。 2、将此片断，克隆到pBR322质粒的Hind 位点，构建成 了ptrpED3表达载体（含有两个Hind 位点）。 3、Hind部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个Hind 位点，经核酸外切酶 和S1核酸酶处理，消除掉构建新的 质粒载体ptrpED5-1.
• 方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变
• 应用：纤维蛋白酶原活化剂，降低血浆清 除率，延长血浆半衰期
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1、重叠延伸PCR技术
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重 叠 延 伸 PCR 介 导 的 定 点 突 变
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2、快速定点突变
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质粒
外源DNA
酶切割
限制性内切酶
限制性内切酶
蛋白基因
退火
目的基因
受体细胞
新突变质粒
转化
类型 亲和标记 特点 专一性标记酶活性部位 不可逆 专一性标记酶活性部位 不可逆 光反应基团 应用 分离细胞表面受体
光亲和标记
发现疾病相关的靶位点 鉴别蛋白质
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三、蛋白质的聚乙二醇修饰
• PEG特点：亲水、不带电荷 • 结合机制：共价结合，形成屏障保护抗原，阻止免 疫反应和酶的水解 • 修饰方式：活化-OH（剧烈条件） • 偶连基团：氨基、巯基、羧基 • 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、 酶降解作用降低…… ? • 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶 PEG 修饰脂质体包被的阿霉素
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化学修饰影响条件
1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个 必要条件；
2、pH值变化：决定了具有潜在反应能力的基团所
处的可反应和不可反应的离子状态；
3、温度：影响活性巯基的微环境
4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机
溶剂可使蛋白质变性。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
特点：试剂对被修饰基团、修饰部位具有专一性
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2. SD序列提供核糖体结合位点
mRNA在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位
点（ribosome binding site）的存在。SD序列（ShineDalgarno sequence）位于转录起始位点上游8～13 bp处，
为富含嘌呤的短片段，其能与核糖体30S小亚基中的16S
rRNA 3′端的部分序列互补结合。SD序列作为核糖体结 合位点，保证了翻译起始复合物的形成。
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大肠杆菌中表达体系的不足：
1、真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。
2、真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可 能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3、真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核 基因mRNA稳定性。