蛋白的分离纯化详解

吸附性质
• 原理：根据次级键相互作用。 • 方法：吸附层析
变性和复性
• 原理：蛋白质在一定的理化条件下失 去原有的空间结构、生物学功能及部 分理化特性等称为变性。当变性条件 去除后恢复原有的空间结构及生物学 功能即为复性。 • 方法：尿素变性复性从包涵体中纯
化原核表达蛋白
二、蛋白质的分离纯化
分离纯化流程
蛋白质的浓缩
1. 超滤法 2. 冷冻干燥法
3. 沉淀法
三、蛋白质的鉴
定
1. 蛋白质的含量测定 2. 蛋白质分子量的测定 3. 蛋白质免疫印迹技术
蛋白质的含量测定
• 目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的
总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品 中某一特定蛋白成分的含量； • 最常用的蛋白定量方法是凯氏定氮法， Lowry Folin法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等。
样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。
SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的
• 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有
的话）的分子量；
• SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量；
• 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE
可测得蛋白质每条多肽链的分子量。 • 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的 许多信息。
Flag-tag (DYKDDDDK)
Myc-tag (EQKLISEEDL)
亲和层析中的三大通用技术
1. 免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲
和柱可用于抗原蛋白的纯化；
2. 凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性 和糖类和糖复合物结合的蛋白质，固定化凝 集素可用于糖蛋白纯化； 3. 染料亲和层析：有多种染料可与各种类型的 酶结合，又不受酶的作用，可用于多种蛋白 的分离。
• 等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）
• 双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）
聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）
• 凝胶由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（bis） 经共聚合而成，此过程在TEMED和过硫酸铵催化 下聚合成网状结构的凝胶。 • 凝胶的孔径可在较宽范围内变化，以迎合不同的分 离需要。
PAGE的分类
根据凝胶的均匀性（孔径、pH）可分为连续与 不连续两类； 根据是否加蛋白质变性剂，可分为变性与非变性 两类； 根据是否加还原剂2-巯基乙醇或DTT，可分为还 原与非还原两类； 还可根据电泳装置的不同，分为圆盘电泳和平板 电泳。
不连续PAGE
不连续平板PAGE，是使用 最广泛的蛋白质电泳
离蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。
• 基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第
二相SDS-PAGE。
双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不
同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDSPAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面 上分开。
应用 凝胶中蛋白的检测
3. 蛋白质分子量的测定
SDS-PAGE测定分子量 凝胶过滤层析法测定分子量 质谱法
1. SDS-PAGE测定分子量
• 基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键， 并按一定比例（1g蛋白质结合1.4g SDS）和蛋白质组 成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身
的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。
平衡离子：H+, Na+, Cl-, OH-
基本操作过程
1. 样品制备，装柱与平衡 2. 上样（样品溶解于A液中）
3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰
4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
• 分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动 相分次洗脱样品蛋白的方法； • 梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。 • 目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情 况下的首选方案。
2. 等电聚焦电泳
• 根据蛋白质的等电点进行分离的一种技术。 • 基本原理：利用两性电解质载体形成一个连续而稳 定的线性pH梯度，使pH从正极到负极逐渐增加。 蛋白质分子在偏离其等电点的pH位置带电，因此 在电场中可以移动；当蛋白质移动到pH等于pI位点，
其静电荷为0，在电场中不再移动，据此可将不同
称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附
到载体上。
膜种类
– 硝酸纤维素NC膜 – PVDF膜 – 尼龙膜
膜的特点
转膜方法 重点
半干法
将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓 冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在 转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。
• 原理：由于蛋白质分子表面亲
水性和疏水性带电基团不同， 因此在溶剂中的溶解度不同。
• 方法： – 盐析法 – 有机溶剂沉淀法 – 等电点沉淀法
配体特异性结合 重点
• 原理：将具有亲和结合的两个分子中 的一个固定在不溶性基质上，来分离 另一个分子。 • 分类 – 免疫亲和层析 – 生物亲和层析 – 金属螯合亲和层析 – 拟生物亲和层析
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎 研磨 超声 渗透压 酶
蛋白溶解 酸、碱 醇 去垢剂 尿素
粗提 沉淀 相分离 分子筛 ……
精提 各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
保存 浓缩 保存状态 保存条件 保存期限
……
……
……
• 分离纯化流程 • 预处理（沉淀、粗分离）-纯化（离子交换）
细胞破碎
机械方法：
图像采集和分析
蛋白鉴定
分离蛋白质组所有蛋白
（1） IEF等电聚焦电泳
pH 3 10
（2）SDS-PAGE （3）染色脱色
图像分析
在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，
需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析， 以寻找差别表达蛋白。常用的软件如安玛西 亚公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。
pI的蛋白质分离。
等电聚焦的优缺点
1. 优点 ① 样品加样位置和体积不受限制； ② 分辨率高于其它类型电泳； ③ 可测定pI值； 2. 缺点 ① 样品在pI区域易沉淀，为增加样品溶解度， 可以在胶中加入尿素，但导致蛋白质失活； ② 样品前处理麻烦。
3. 双向电泳（概念、原理、作用、用途）
• 将等电聚焦技术与SDS-PAGE技术组合起来的新技术，是目前分
基本操作步骤
1. 样品的制备 2. 细胞裂解物的SDS-
PAGE
3. 蛋白质的转移
4. 目的蛋白的检测
印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（ NC ）膜
和PVDF膜。 为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即 用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐 温20等封闭载体上印迹以外的剩余吸附点（该过程
搅拌、振动 研磨 压滤 超声 匀浆
非机械方法：
干燥
渗透压 冻融 酶
蛋白的溶解
体积
离子强度 pH 温度
蛋白质的稳定
蛋白质的粗分离
• 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后， 蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低， 采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩， 同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属 于蛋白质的粗分级。 • 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超 速离心、等电点沉淀(重点)、透析、超过滤、 蛋白质结晶等。
电泳（electrophoresis）
• 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电 极移动的现象称为电泳。蛋白质在电场中 泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相 反的力的作用 • 蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流 电场聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS--PAGE）
• 2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒 形，其轴长与分子量成正比。
2. 凝胶过滤层析法测定分子 量
• 蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其
分子量的关系如下式所示：
lg Mr＝K1－K2 Ve
• 在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的
Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出
目前常用的印迹法： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 重点
蛋白质印迹的用途
• 用于检测样品中是否有特定蛋白的存在， 并进行半定量分析。
Western blotting原理图示
原理（问度娘）
• Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶 电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗 体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚 丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且 能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活 性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作 为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与 酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过 底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术 也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
电转仪
转膜后检测
丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗 硝酸纤维素滤膜，换水几次。
探针是用化学方法将能与待研究蛋白质结合的物 质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物 质、半抗原等结合形成的复合物。 蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或 AP酶）。
质谱法是最精确的分子量测定方法
• 质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电 原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的 大小顺序排列的图谱。测定蛋白质分子量 的精确度为0.01～0.1％。
4. 蛋白质免疫印迹技 术