琥珀酸脱氢酶竞争性抑制

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琥珀酸脱氢酶
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琥珀酸脱氢酶是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是 线粒体内膜的一个重要部分，其它酶大多存在于 线粒体的基质 ，作用于有氧呼吸过程。
作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是 反映线粒体功能的标志酶（markerenzyme）之 一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度 的指标，对于评价精子线粒体功能、研究致奶牛 酮缺乏症病理过程等具有重要意义。
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二、实验原理
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酶的竞争性抑制作用
抑制剂和底物的结构相似，可与 底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底 物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
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HOOC—CH2—CH2—COOH
草酸
琥珀酸脱氢酶
HOOC—COOH
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
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琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二
甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应ห้องสมุดไป่ตู้化
琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光
度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋
PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋
SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准
=μmol/min/mg。
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2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底
物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与 Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸 光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱 氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活 力愈强。
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3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为
人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原 成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存 在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋 、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液 测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶 活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出 TTC-脱氢酶活性
琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
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琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法 2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
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酶的肝糜液
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实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
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编号
1
2
3
4
5
0.25%琥珀 0.50
——
0.50
2.00
0.50
酸钠溶液
/ml
0.5%草酸 ——
0.50
0.50
0.50
2.00
钠溶液/ml
蒸馏水/ml 2.00
2.00
1.50
——
——
肝糜液/ml 1.00
1.00
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思考题：
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5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺 陷与改进方案？
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补充：
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琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简 称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶， 属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢 纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需 氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标 志酶。
草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧 结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色） 作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲 烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的 快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色 消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。
1.00
1.00
1.0
甲烯蓝/ml 0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
摇匀，静置于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记 录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并 分析产生该现象的原因。
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注意事项：
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1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢 酶尽量释放到溶液里
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实验器材与试剂：
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（二）器材 研钵.手术剪.手术镊子 2mL移液管 1000 uL微量可调仪器 10mL离心管 低速离心机
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实验操作：
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(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充
分研磨至糊状 分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml 搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟 将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢
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5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法 NBT易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体
，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而 形成紫蓝色的沉淀，于反应体系中加入PMS，混 匀，37℃保温30min，之后加入TCA终止反应。 加异丙醇溶解显色，混匀，即可于548nm测OD 值。规定：30min内548nm下OD值为1.0时的酶 量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白 。
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竞争性抑制的机理
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⑴ 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产 物；
⑵ 抑制剂与酶的结合部位（活性中心）与底物与 酶的结合部位相同；
⑶ 抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底 物浓度可使抑制程度减小；
⑷ 动力学参数：Km值增大，Vm值不变。抑制程 度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比 例 注意：结合在酶的同一部位以及结构类似并不 是竞争性抑制的必要条件，抑制剂结合的部位阻 碍底物和酶的结合，即产生空间位阻也可以造成 竞争性抑制。
2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要 相等的离心管对称放置
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振 荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊
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思考题： LOGO
1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在 摇动?
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲 烯白重新氧化成甲烯蓝
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4.MTT法 MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中
琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色 素C的作用下生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的 甲臜（Formazana），经异丙醇作用颗粒溶解显 色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正 比，因此可根据光密度570nm处OD值推测出活 细胞的数目。
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琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
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实验目的：
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(1)学习动物的处死与组织匀浆的方法。 (2)学习离心机的使用方法。 (3) 进一步理解酶的竞争抑制原理。
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实验原理：
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竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞 争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的 抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。
DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这
种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化
与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出
SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧
化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算
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思考题：
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2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本 实验成功的关键是什么？
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思考题：
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3：抑制剂还可以选用什么物质？
还可以选用丙二酸
4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点 ？
竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物 ；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部 位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大； 但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参 数：Km值增大，Vm值不变。
FAD
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MBH2甲烯白（无色）
HOOC—CH=CH—COOH
FADH2
MB甲烯蓝（蓝色）
在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢 酶活性的改变。
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实验器材与试剂:
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（一）试剂 pH=7.4的磷酸缓冲液 0.25%琥珀酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 0.01%甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡