乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性

浙江农业学报 Aeto，2017，29(2) : 332 -337 http：// 蒋喰，刘娇，郦萍，等.乳酸菌细菌素plantancm JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性[J].浙江农业学报，2017,29(2): 332 -337.

DOI：10. 3969/j. issn. 1004-1524. 2017. 02. 21

乳酸菌细菌素plantaridn J K的异源表达、分离纯化及抗菌活性蒋晗刘娇1，郦萍1，顾青^

(1.浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室，浙江杭州310018; 2.中国计量大学浙江省海洋食品品质及危害物控制技 术重点实验室，浙江杭州310018)

摘要:为获得高产双肽细菌素plantaricin JK,通过PCR扩增获得一 J和一X基因，构建表达载体PET32a (+ )J-BL21 (DE3)和PET32a( + )-pfc X-BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达后，利用镍亲和层析柱进行分离 纯化，重组蛋白经肠激酶酶切纯化后，细菌素pin J和pin K的产量分别为2 ~3、5 ~8 m g i-1。利用牛津杯平 板抑菌法研究抗菌活性，结果显7K细菌素pin J和pin K对梓檬色葡萄球菌（cdreus)、大肠埃希 菌(£^e/te r^ia〇>/纟）、藤黄微球菌和单核细胞增生李斯特菌mo/ioeytoge/ies)都有明 显抑制作用，且双肽细菌素plantaricin JK的抑菌圈直径大于单独的细菌素pin J或pin K。

关键词:plantaricin JK;异源表达;分离纯化;抗菌活性

中图分类号:Q786 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2017)02-0332-06

Heterologous expression and purification of plantaridn JK and analysis of its antibacterial

activity

JIANG Han1’2, LIU Jiao1，LI Ping1，GU Qing1’*

(1. Key Laboratory fo r Food M icrobial Technology o f Zhejiang Province, Zhejiang G ongshang U niversity, H angzhou

310018, C h in a；2. Key Laboratory o f M arine Food Q uality and H azard Controlling Technology o f Zhejiang Province,

China Jiliang U niversity, H angzhou 310018, C hina)

Abstract：In order to obtain the high-yield two-peptide bacteriocin plantaricin JK, pin J and pin K were successfully heterologously expressed in Escherichia coli BL21 ( DE3 ) , and were induced by IPTG. Then the two peptides were expressed as His6-tag fusion proteins and were separated by Ni2+ chelating affinity chromatography. The fusion pro­teins were cleaved by enterokinase and further purified. The yields of pin J and pin K were around 2-3 and 5-8 mg*

L 1. The antibacterial activity of the peptides against 4 indicator strains, i. e. Staphylococcus citreus, Escherichia co­

li ,Micrococcus luteus, Listeria m onocytogenes, was analyzed by agar diffusion method. It was shown that pin J and pin K both could inhibit the growth of the 4 indicator strains, but plantaricin JK had larger inhibition zone than pin J or pin K alone.

Key words：plantaricin JK；heterologous expression；expression and purification；antibacterial activity

收稿日期=2016-12-12

基金项目：国家国际科技合作专项(2013D F A32330);国家自然科学基金项目（31540044,31271821);国家高技术研究发展计划（863计 划）（2014AA022210-08)

作者简介:蒋晗（1987—），女，浙江杭州人，博士研究生，研究方向为食品生物技术。E-m ail: jianghan825@

* 通信作者，顾青，E-m ail: guqing2002@

蒋晗，等.乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性• 333 •

乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB )是美国食 品与药品监督管理局（F D A)认定的食品级微生 物，乳酸菌及其代谢产物一般被认为是安全的 (generally regarded as safe, GRAS) [1]。乳酸菌细 菌素作为一种天然的食品防腐剂，其原始产生菌 对细菌素具有自身免疫性，又因为其本质为蛋白 质或多肽，所以能够被胃肠道内的蛋白酶降解，具有高效、无毒、无残留、无抗药性、耐酸、耐高温 等特点，受到各国科学家的关注[2_3]。目前，已在乳球菌、片球菌、双歧杆菌、肠球菌、明串珠菌、链球菌、肉食杆菌、乳杆菌等8属的乳酸菌中发 现40多种乳酸菌细菌素[4]。

笔者所在实验室团队从健康婴儿粪便中筛 选到1株具有良好抑菌活性的新型植物乳杆菌 (Lactobacillfjis plantarum)ZJ316 ,经全基因组测

序，发现其基因簇中含有编码二肽细菌素plantar­icin JK 的基因 _/和 X[5]。天然 plantaricin J K的分离纯化方法复杂，表达困难且产量很低，不利于大规模生产和后续深入研究，化学合成细 菌素效率高，可用作深入研究，但成本太高不利 于市场应用;而异源表达在提高细菌素产量上提 供了新的可能。在所有的表达宿主中，大肠埃希 菌(&c/ieric/iia cc/i)被认为是遗传背景最清楚、表 达系统最成熟完善的基因工程菌。Plantaricin JIC 属于Class l i b类细菌素，少有翻译后修饰，是基 因工程技术的主要研究对象。本研究拟以细菌 素pin J和pin K为研究对象，通过基因工程手段 将其在c〇Z i BI21 (DE3)中表达，形成带His 标签的融合蛋白，经镍柱纯化和肠激酶酶切分离 纯化后，再采用RT-HPLC纯化，获得高产高纯并 有抑菌活性的双肽细菌素plantaricin JK,为其作 为生物防腐剂投入市场提供可能。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株与载体

宿主菌c〇Z i D H5a购自宝生物工程（大 连）有限公司,c〇Z i BL21 (D E3)购自 New Eng­land Biolabs (N E B, USA) 公司 。克隆载体 PUC57 和表达载体pET 32a( + )购自美国Novagen公 司。抗菌活性检测菌株藤黄微球菌（Micrococci^

,梓樣色葡萄球菌（Stap/iyZocciccMj cifrewj),单核细胞增生李斯特菌（m craccytageraes)和大肠埃希菌(£. 均为本实验室保存。

1.1.2主要仪器

蛋白质快速纯化系统AKTA purifier 100, GE;蛋白质垂直电泳系统，Bio-Rad;台式高速冷 冻离心机3K30,Sigma;恒温振荡器DHZ-C-1,太 仓市实验设备厂;超净台SW-CJ-2FD,上海博迅; 高压细胞破碎仪AH-1500,德国力士乐。

1.1.3主要试剂

D N A电泳和蛋白电泳所需试剂均购自生工 生物工程(上海）有限公司。PCR试剂购自Taka- ra公司。SanPrep柱式质粒D N A小量抽提试剂 盒、SanPrep柱式P C R产物纯化试剂盒、SanPrep 柱式D N A胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海）有限公司。肠激酶购自英国New England Biolabs (N

E B)公司。引物由生工生物工程（上 海)有限公司合成。

1.2试验方法

1.2.1 基因片段设计与合成

基因片段_/和X的序列来自于实验 室分离的植物乳杆菌ZJ316,去除前导序列，添加 1个肠激酶位点（用斜体表示）（5 ’ -GATGATGAT- GATAAA-3 ’）和2个限制性内切酶位点（用下划 线表示）—KPn I(-GGTACC-) ,A^co I(- CCATGG-),两端最后加入保护碱基，并由生工生 物工程（上海）有限公司合成。完整序列如下。

pin J：CGGGGTACCGATGATGATGATAAAGG-CGCTTGGAAAAATTTCTGGTCTAGTTTAAGAAAA- GGATTTTATGATGGCGAAGCTGGCAGAGCAATC- CGTCGTTAACCATGGCATG ；

pin K：CGGGGTACCGATGATGATGATAAACG-TC GGAGTC GTA A A A A TGGA A TTGGAT A C GCTAT- TGGTTATGCGTTTGGCGCGGTTGAACGGGCCGT- GCTTGGTGGTTCAAGGGATTATAATAAGTGACC- ATGGCATG。

1.2.2引物设计及PCR扩增

根据合成的碱基序列设计相应引物。I 和他。I酶切位点用下划线表示。_/的引物: P1, 5 ’-CGGGGTACCGATGATGATGATAAAGGC- 3 ’ ；P2, 5 ’ -CATGCCATGGTTAACGACGGATTG- 3 ’。X的引物:P3 ,5，-CGGGGTACCGATGAT-