芯片应用
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different tumor classes • Identification of genes associated with clinical
outcomes (e.g. survival)
mRNA levels compared in many different contexts
• D源自文库fferent tissues, same organism (brain v. liver) • Same tissue, same organism (tumor v. non-
以普遍接受的国际医药学语言，使中药从根本 上实现现代化、国际化。
基因芯片在抗癌中药紫龙金片 二次开发中的应用
• 采用人类全基因组表达谱芯片技术，建立 筛选模式生物体系，破解中成药紫龙金片 对人肺癌细胞株基因的作用机制以获取肺 癌预测和诊断所需分子标识，探索紫龙金 片扶正作用的生物途径。
实验所用细胞株：
cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha zinc finger RNA binding protein minichromosome maintenance complex component 6 hematological and neurological expressed 1-like polymerase (DNA directed), alpha 1, catalytic subunit
– 药物处理前这4株肺癌细胞中有6个基因表达为上调， 其余7个基因表达为下调；
– 药物处理后表达模式发生逆转，上调的基因转为下调， 下调基因的转为上调
证明了紫龙金药物的药效和对基因表达的调控作用。
• 这13个基因在给药前后的变化为我们筛选肺癌基 因分子标识和寻找药物作用靶点提供了可靠证据， 也有助于在分子水平上阐释紫龙金片的作用机制。
jun oncogene
X-linked inhibitor of apoptosis serpin peptidase inhibitor, clade E (nexin, plasminogen activator inhibitor type 1), member 1 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2 adenylate cyclase 9 minichromosome maintenance complex component 6 cyclin E2
A549-22 A549-B H460-22 H460-B H520-22 H520-B H446-22 H446-B MRC-5-22 MRC-5-B
总 RNA提取电泳图
表达谱试验操作
芯片扫描全景图
芯片扫描左上角放大图
层次聚类分析图
• 差异显著并具有相同变化趋势的基因483个， 其中上调基因170个，下调基因313个。
A549 H520 H460 H446
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1.6
Growth inhibition
2.2
3.3
A549 H460 H520 H446 16HBE MRC-5
6.6
细胞生长抑制率．A549、H460、H520、H446、16HBE、MRC-5每株细胞 加紫龙金药处理24h，浓度分别为16mg/ml、22mg/ml、33mg/ml、 66mg/ml．
• 现在制备的多为石蜡标本组织芯片
组织芯片制备过程
芯片实验室（微流控芯片）
• 基因芯片及其作用原理 基于核酸探针杂交技术原理而研制的，一
般包括DNA微阵列制备、样品制备、杂交和 信号的检测分析
• 蛋白芯片 蛋白芯片是将各种蛋白质有序固定于滴定
板、滤膜、玻片等各种载体上，然后用荧光 标记抗体或其他成分与芯片作用，经洗脱、 扫描、检测分析蛋白质之间的相互关系。
Fold change -4.83 -3.69
11.76
5.85
5.21
-3.18 -2.71 -4.05 -5.17
4.35 9.79 3.12 -4.05 -3.67 -2.57
表2. 代谢通路(续)
Pathway Electron_Transport_Chain Fatty_Acid_Degradation G_Protein_Signaling G1_to_S_cell_cycle_Reactome
紫龙金药物溶液浓度
7个浓度
– 用各种细胞的培养基配置实验药物并梯度稀释，浓 度分别为：
• 133mg/ml • 66mg/ml • 33mg/ml • 22mg/ml • 16.5mg/ml • 8.25mg/ml • 4.125mg/ml
细胞生长试验
• 培养好的细胞+不同浓度的药物处理细胞 • 测OD550值，观察药物处理效果
• 按功能进行聚类分析后将差异表达的基因 分为63个大类，发现其主要涉及细胞生理 过程的正负调控、代谢、胞内细胞器、膜 结合细胞器、细胞核、细胞周期和转录等。
• 根据已知数据库信息，进一步将63大类， 归纳为25个通路。
• 对具代表性的3个通路（细胞凋亡通路、细胞周期 通路、Wnt信号通路）中的13个相关基因进一步 研究，发现
Microarrays provide a means to measure gene expression
Areas being studied with Microarrays
• Differential gene expression between two (or more) sample types.
生物芯片的应用
生物芯片分类
据芯片探针的不同 • 组织芯片 • 芯片实验室（Lab-on-a-chip） • 基因芯片（Gene chip，DNA chip，DNA
microarray） • 蛋白芯片（Protein chip）
组织芯片
• 组织芯片（tissue chip）:也称组织微阵列， 是生物芯片技术的一个重要分支，是将许 多不同个体组织标本以规则阵列方式排布 于同一载玻片，进行同一指标的原位组织 学研究。
Probe set 227350_at 223556_at 201466_s_ at 206536_s_ at 202627_s_ at 212361_s_ at 204497_at 238977_at 205034_at 202284_s_ at 203725_at 213286_at 238977_at 212109_at 204835_at
G13_Signaling_Pathway Glycolysis_and_Gluconeogenesis GPCRDB_Other
生物芯片的应用
• 生物学与医学研究
• 基因表达谱、功能基因组等
• 临床诊断和其他生物检测
– 与其他检测手段的竞争
• 个人基因档案
– 个体化医学、药物开发
表达谱芯片
Measuring Gene Expression
Idea：Measure the amount of mRNA to see which genes are being expressed in (used by) the cell. Measuring protein would be more direct, but is currently harder.
• 用基因表达差异谱数据库筛选现代中药，为中 药现代化研究提供了一个全新的思路和方向。
该方法将中药与现代基因组学的疾病相关基因 表达和现代药物学化学物质的作用在功能上统
一起来，能够在中药和基因表达之间架起一座
桥梁，在基因表达水平上解释中药理论和中药 的作用机制。这样可使中药成为作用机制明确、
物质基础清楚的药物，使中药理论成为人们可
Numbers of genes
215 176 174 170 165 146 146 137 137 106 93 91 88 87 86 41 31 31 29
p value
0.000188 0.00001 0.000096 0.000015 0.000011 0.000261 0.000261 0.000009 0.000009 0.000002 0.00006 0.000009 0.000028 0.000012 0.000186 0.000479 0.000036 0.000009 0.000463
肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种基本 类型，实验选取五株细胞，进行紫龙金表达谱实验。
• 非小细胞肺癌的
– 人腺癌肺癌细胞（A549） – 人肺鳞癌细胞（H520） – 人大细胞肺癌细胞（H460）
• 小细胞肺癌
– 人小细胞肺癌细胞（H446） – 人正常细胞人胚肺成纤维细胞（MRC-5）
（均购自中国医学科学院肿瘤细胞库）
OD值 OD值
A549 H520 H460H446药物处理结果
5 4.5
4 3.5
3 2.5
2 1.5
1 0.5
0 132
66
33
22
16.5
药物浓度（mg/ml）
Blank
A549 H520 H460 H446
3 2.5
2 1.5
1 0.5
0 24h
药物处理时间梯度实验结果
48h
72h
96h
时间（h）
表1. 基因功能分组
Function groups
cellular physiological process intracellular metabolism cellular metabolism primary metabolism intracellular organelle organelle intracellular membrane-bound organelle membrane-bound organelle nucleus regulation of biological process regulation of cellular process regulation of physiological process regulation of cellular physiological process nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism transcription regulator activity cell cycle negative regulation of biological process transcription, DNA-dependent
tumor) • Same tissue, different organisms (W+ v.
mutant) • Time course experiments (effect of +++,
development)
基因芯片在抗癌中药紫龙金片 二次开发中的应用
• 中医药擅长于从整体上进行功能的调节， 在作用方式上具有多成份、多环节、多靶 点的特性。这些复杂的特点，以往的药物 研究方法，很难从整体到细胞水平，甚至 是蛋白质水平进行全面地研究。
• Similar gene expression across treatments • Tumor sub-class identification using gene
expression profiles • Classification of malignancies into known classes • Identification of “marker” genes that characterize
表2. 代谢通路
Pathway Apoptosis
Blood_Clotting_Cascade Calcium_regulation_in_cardiac_cell s Cell_cycle
Circadian_Exercise DNA_replication_Reactome
Gene title helicase, lymphoid-specific helicase, lymphoid-specific
outcomes (e.g. survival)
mRNA levels compared in many different contexts
• D源自文库fferent tissues, same organism (brain v. liver) • Same tissue, same organism (tumor v. non-
以普遍接受的国际医药学语言，使中药从根本 上实现现代化、国际化。
基因芯片在抗癌中药紫龙金片 二次开发中的应用
• 采用人类全基因组表达谱芯片技术，建立 筛选模式生物体系，破解中成药紫龙金片 对人肺癌细胞株基因的作用机制以获取肺 癌预测和诊断所需分子标识，探索紫龙金 片扶正作用的生物途径。
实验所用细胞株：
cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha zinc finger RNA binding protein minichromosome maintenance complex component 6 hematological and neurological expressed 1-like polymerase (DNA directed), alpha 1, catalytic subunit
– 药物处理前这4株肺癌细胞中有6个基因表达为上调， 其余7个基因表达为下调；
– 药物处理后表达模式发生逆转，上调的基因转为下调， 下调基因的转为上调
证明了紫龙金药物的药效和对基因表达的调控作用。
• 这13个基因在给药前后的变化为我们筛选肺癌基 因分子标识和寻找药物作用靶点提供了可靠证据， 也有助于在分子水平上阐释紫龙金片的作用机制。
jun oncogene
X-linked inhibitor of apoptosis serpin peptidase inhibitor, clade E (nexin, plasminogen activator inhibitor type 1), member 1 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2 adenylate cyclase 9 minichromosome maintenance complex component 6 cyclin E2
A549-22 A549-B H460-22 H460-B H520-22 H520-B H446-22 H446-B MRC-5-22 MRC-5-B
总 RNA提取电泳图
表达谱试验操作
芯片扫描全景图
芯片扫描左上角放大图
层次聚类分析图
• 差异显著并具有相同变化趋势的基因483个， 其中上调基因170个，下调基因313个。
A549 H520 H460 H446
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1.6
Growth inhibition
2.2
3.3
A549 H460 H520 H446 16HBE MRC-5
6.6
细胞生长抑制率．A549、H460、H520、H446、16HBE、MRC-5每株细胞 加紫龙金药处理24h，浓度分别为16mg/ml、22mg/ml、33mg/ml、 66mg/ml．
• 现在制备的多为石蜡标本组织芯片
组织芯片制备过程
芯片实验室（微流控芯片）
• 基因芯片及其作用原理 基于核酸探针杂交技术原理而研制的，一
般包括DNA微阵列制备、样品制备、杂交和 信号的检测分析
• 蛋白芯片 蛋白芯片是将各种蛋白质有序固定于滴定
板、滤膜、玻片等各种载体上，然后用荧光 标记抗体或其他成分与芯片作用，经洗脱、 扫描、检测分析蛋白质之间的相互关系。
Fold change -4.83 -3.69
11.76
5.85
5.21
-3.18 -2.71 -4.05 -5.17
4.35 9.79 3.12 -4.05 -3.67 -2.57
表2. 代谢通路(续)
Pathway Electron_Transport_Chain Fatty_Acid_Degradation G_Protein_Signaling G1_to_S_cell_cycle_Reactome
紫龙金药物溶液浓度
7个浓度
– 用各种细胞的培养基配置实验药物并梯度稀释，浓 度分别为：
• 133mg/ml • 66mg/ml • 33mg/ml • 22mg/ml • 16.5mg/ml • 8.25mg/ml • 4.125mg/ml
细胞生长试验
• 培养好的细胞+不同浓度的药物处理细胞 • 测OD550值，观察药物处理效果
• 按功能进行聚类分析后将差异表达的基因 分为63个大类，发现其主要涉及细胞生理 过程的正负调控、代谢、胞内细胞器、膜 结合细胞器、细胞核、细胞周期和转录等。
• 根据已知数据库信息，进一步将63大类， 归纳为25个通路。
• 对具代表性的3个通路（细胞凋亡通路、细胞周期 通路、Wnt信号通路）中的13个相关基因进一步 研究，发现
Microarrays provide a means to measure gene expression
Areas being studied with Microarrays
• Differential gene expression between two (or more) sample types.
生物芯片的应用
生物芯片分类
据芯片探针的不同 • 组织芯片 • 芯片实验室（Lab-on-a-chip） • 基因芯片（Gene chip，DNA chip，DNA
microarray） • 蛋白芯片（Protein chip）
组织芯片
• 组织芯片（tissue chip）:也称组织微阵列， 是生物芯片技术的一个重要分支，是将许 多不同个体组织标本以规则阵列方式排布 于同一载玻片，进行同一指标的原位组织 学研究。
Probe set 227350_at 223556_at 201466_s_ at 206536_s_ at 202627_s_ at 212361_s_ at 204497_at 238977_at 205034_at 202284_s_ at 203725_at 213286_at 238977_at 212109_at 204835_at
G13_Signaling_Pathway Glycolysis_and_Gluconeogenesis GPCRDB_Other
生物芯片的应用
• 生物学与医学研究
• 基因表达谱、功能基因组等
• 临床诊断和其他生物检测
– 与其他检测手段的竞争
• 个人基因档案
– 个体化医学、药物开发
表达谱芯片
Measuring Gene Expression
Idea：Measure the amount of mRNA to see which genes are being expressed in (used by) the cell. Measuring protein would be more direct, but is currently harder.
• 用基因表达差异谱数据库筛选现代中药，为中 药现代化研究提供了一个全新的思路和方向。
该方法将中药与现代基因组学的疾病相关基因 表达和现代药物学化学物质的作用在功能上统
一起来，能够在中药和基因表达之间架起一座
桥梁，在基因表达水平上解释中药理论和中药 的作用机制。这样可使中药成为作用机制明确、
物质基础清楚的药物，使中药理论成为人们可
Numbers of genes
215 176 174 170 165 146 146 137 137 106 93 91 88 87 86 41 31 31 29
p value
0.000188 0.00001 0.000096 0.000015 0.000011 0.000261 0.000261 0.000009 0.000009 0.000002 0.00006 0.000009 0.000028 0.000012 0.000186 0.000479 0.000036 0.000009 0.000463
肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种基本 类型，实验选取五株细胞，进行紫龙金表达谱实验。
• 非小细胞肺癌的
– 人腺癌肺癌细胞（A549） – 人肺鳞癌细胞（H520） – 人大细胞肺癌细胞（H460）
• 小细胞肺癌
– 人小细胞肺癌细胞（H446） – 人正常细胞人胚肺成纤维细胞（MRC-5）
（均购自中国医学科学院肿瘤细胞库）
OD值 OD值
A549 H520 H460H446药物处理结果
5 4.5
4 3.5
3 2.5
2 1.5
1 0.5
0 132
66
33
22
16.5
药物浓度（mg/ml）
Blank
A549 H520 H460 H446
3 2.5
2 1.5
1 0.5
0 24h
药物处理时间梯度实验结果
48h
72h
96h
时间（h）
表1. 基因功能分组
Function groups
cellular physiological process intracellular metabolism cellular metabolism primary metabolism intracellular organelle organelle intracellular membrane-bound organelle membrane-bound organelle nucleus regulation of biological process regulation of cellular process regulation of physiological process regulation of cellular physiological process nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism transcription regulator activity cell cycle negative regulation of biological process transcription, DNA-dependent
tumor) • Same tissue, different organisms (W+ v.
mutant) • Time course experiments (effect of +++,
development)
基因芯片在抗癌中药紫龙金片 二次开发中的应用
• 中医药擅长于从整体上进行功能的调节， 在作用方式上具有多成份、多环节、多靶 点的特性。这些复杂的特点，以往的药物 研究方法，很难从整体到细胞水平，甚至 是蛋白质水平进行全面地研究。
• Similar gene expression across treatments • Tumor sub-class identification using gene
expression profiles • Classification of malignancies into known classes • Identification of “marker” genes that characterize
表2. 代谢通路
Pathway Apoptosis
Blood_Clotting_Cascade Calcium_regulation_in_cardiac_cell s Cell_cycle
Circadian_Exercise DNA_replication_Reactome
Gene title helicase, lymphoid-specific helicase, lymphoid-specific