聚谷氨酸讲课讲稿

菌种的筛选
复筛
制备液体种子培养基并灭菌，分别从保藏的新鲜斜面上取一至两环 菌接入种子培养基（50mL/150mL锥形瓶），37℃、150r/min 24h。 按2%的接种量，分别将种子液接到装有120ml灭菌基本发酵培养基中， 37℃ 150r/min 96h. 菌种保存方法
② B. subtilis IFO3335 发酵生产 γ-聚谷氨酸
B. subtilis IFO3335 是从一种传统的日本食品“纳豆”中 分离出来的，是一种 L-Glu依赖型菌株。外源的L-Glu仅仅 是作为γ-PGA合成酶的激活剂，而用于合成 γ-PGA 的谷氨 酸则是 TCA 循环的中间代谢物。利用这种细菌发酵生产 γ-PGA，产量随培养条件的不同而不同，其范围为20～50 g/L。典型的培养基组成为：L-Glu 30 g/L，柠檬酸 20 g/L， 硫酸铵 5 g/L，培养周期96 h。这个菌株以外源的L-Glu 作 为合成 γ-PGA 的激活剂，而合成 γ-PGA 的主要前体来源 于 TCA 循环，因此，可以尝试直接加入 TCA 循环中间代 谢物，考察 γ-PGA 的产量，选出最佳前体添加物，以进 一步提高产量。
农业方面
作为植物增产营养素
超强亲水性与保水能力，
02
可作为肥料增效剂，并增 加植物抗病能力
平衡土壤酸碱度
可结合沉淀有毒重金属
04 其他方面
污水处理，如重金属 吸收剂或螯合剂 卫生用品，婴儿尿布 及妇女卫生巾等 保湿作用，用于化妆 品
02 PART TWO
菌种的分离与发酵
产γ-PGA的菌株，菌种的筛选，培养基
这类菌种主要有B.subtilis5E、B. subtilisvar. polyglutamicum 、 B. licheni-formisA35 、 B.subtilis TAM4 等。
①B. licheniformis9945a 发酵生产 γ-聚谷氨酸
1942 年发现 B. licheniformis9945a 能够生产γ-PGA，接 着相关培养基设计和发酵条件优化的研究相继展开。研究 表明，盐浓度、L-Glu、甘油和柠檬酸是生产 γ-PGA 的主 要影响因素，Mn2+和 Ca2+对γ-PGA的产生也有显著影响。 最优培养基组成如下：柠檬酸12 g/L，甘油 80 g/L， NH4Cl 7 g/L，MgSO4 0.5g/L，FeCl3 0.04 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，pH=7.4。2～3 天培养后， γ-PGA的产量为 15g/L。B. licheniformis9945a 在此培养条件下，产量较低， 可能是由于没有找到最适的碳氮源、生长因子等。在随后 的研究中，产量高于15 g/L。
聚谷氨酸的发酵生产和分离提取 的工艺研究
课题背景及目的意义 菌种的分离与发酵
产物的提取与鉴定 菌种的鉴定
CONTENTS
目 录
01 PART ONE
课题背景及目的意义
聚谷氨酸的发现，结构特性及其应用
聚谷氨酸（γ-PGA）简介
poly-γ-glutamic acid
γ-PGA最早发现于1937年，研究人员在炭
聚
聚物，是L-Glu和D-Glu以α - 氨基 和γ -
谷
羧基之间经酰胺键的形式 缩合而成的高分
氨 酸
子聚合物。γ-PGA的分子量一般在50kDa
水
到 2 0 0 0 k D a （ 100~1000kDa ） 。 其 保 湿
胶
锁水功效是透明质酸的500倍
γ-PGA的特性
对人体和环境无毒可生物降解 ，生态友好型 A
疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的细胞
荚膜以及糖化菌（Bacilluswenku.baidu.commesentericus）
的细胞荚膜中发现γ-PGA。之后在枯草芽
孢杆菌（Bacillus subtilis )以及纳豆杆菌
土壤级聚谷氨酸
（Bacillus natto )中也发现了γ-PGA。
γ-PGA聚谷氨酸是一种特殊的阴离子自然
产γ-PGA的菌株
能发酵生产γ-聚谷氨酸的菌种较多，有地衣杆菌、枯草 芽孢杆菌等菌种，而以枯草芽孢杆菌发酵生产γ-PGA的研究 居多。 根据细胞生长的营养要求是否需要L-谷氨酸可以把γPGA产生菌分为两大类
L-Glu 依赖型
非 L-Glu 依赖型
这类菌种主要有 B.anthracis、B. subtilisMR-141 、 B. licheniformisATCC9945 、 B. licheniformisATCC9945a、B. subtilis IFO3335、 B. subtilisF-201 和 Madla 和 Prasertsan 等[9]从 温泉中筛选出的B.thrmotolerant WD90.KT12.KF.41等
水溶性，可得到无味清洁透明 的溶液 C
易交联形成后期拥有卓越性 能的水凝胶
B
可制成钠，钙，镁，氢型 D
γ-PGA的应用
食品方面
增加抗冻性，食品冷藏 01
增加抗溶性 增加钙及其他矿物质吸收 抗氧化
医药方面 03
保健品添加剂，促进钙 质吸收 具有良好的生物亲和性 和生物降解性，可用作药物 载体
③ B.subtilis ZJU-7 发酵生产 γ-聚谷氨酸
B.subtilis ZJU-7 是从中国传统食品豆腐乳中分离出来的， 是一种 L-Glu 依赖型菌株，发酵生产γ-PGA 时必须加入外 源谷氨酸。其最适碳源和氮源分别是蔗糖和胰蛋白胨，在 含有60 g/L蔗糖、60 g/L胰蛋白胨和80 g/L L-Glu的培养液 中37 ℃培养24 h 后，γ-PGA 的产量为 54.4 g/L。这是目 前（2008年）报道过的最高产量。然而，考虑到工业化生 产，营养成本较高，生产成本也随之提高。因此，利用农 副产品或者含有 L-Glu的各种废料生产 γ-PGA，降低其生 产成本后，有望工业化。
菌种的筛选
实验材料：土壤 纳豆 豆腐乳 豆豉
初筛 取实验材料2g于10mL无菌水的试管中，用橡胶塞封口，振荡2min,再静 置30min； 水浴锅100℃煮沸5min； 冷却后，取上清液1mL，浓度梯度稀释，分别取0.2mL稀释液涂布于初 筛培养基平板上； 37℃培养24h观察结果，在初筛培养基上挑选呈粘液状能拉丝的单菌落， 将筛选出的单菌落经划线分纯后分别编号，并进行3代传代培养； 最后于枯草芽孢杆菌转接于LB斜面，再经培养有保存于冰箱中（4℃）。