微生物的硝化作用

微生物的硝化作用Revised on November 25, 2020
高级微生物学综述
微生物的硝化作用
学生姓名：任伟帆
学号：
指导教师：唐文竹
所在学院：生物工程学院
专业：生物学
大连工业大学
微生物的硝化作用
摘要：本文主要介绍了硝化作用微生物的种类,包括氨氧化菌、亚硝酸氧化菌、异养氨氧化菌和厌氧氨氧化菌。

分析了硝化微生物的系统发育，还介绍了在硝化作用微生物生态学研究进展，以及同类群细菌中与硝化作用相关的酶类。

文章的最后还分析了微生物脱氮在污水处理中的应用。

关键词：氨氧化细菌；系统发育分析；硝化作用；微生物脱氮
Microbial nitrification
Abstract:This paper introduces the types of nitrifying microorganisms, including ammonia-oxidizing bacteria, nitrous acid, oxidizing bacteria, heterotrophic ammonia-oxidizing bacteria and anaerobic ammonium-oxidizing bacteria. The phylogenetic analysis of microbes was also studied, as well as advances in microbial ecology of nitrification and the enzymes associated with nitrification in the same group of bacteria. Finally, the application of microbial denitrification in sewage treatment was analyzed.
Key words： ammonia-oxidizing bacteria; phylogenetic analysis; nitrification; microbial denitrification
前言
氮元素在自然界中大量存在，是非常丰富的元素之一,它在自然界中主要以分子氮、有机氮化合物和无机氮化合物的形式存在。

它
们在微生物、动物、植物体内相互转移、转化，构成了氮循环[1]。

而微生物在其中起着非常重要的作用，主要通过氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及固氮作用来实现的。

而目前，水体污染越远越
严重，处理难度越来越大，生物处理工艺受到了更多的重视。

因
此，通过深入分析硝化作用微生物的种类及作用机理，不断改进生
物脱氮工艺具有重要意义。

1 硝化作用的微生物种类及其系统发育分析
硝化作用分为两个阶段,即亚硝化(氨氧化)和硝化(亚硝酸氧化) , 分别由两类化能自养微生物完成,亚硝化细菌进行氨的氧化,硝化细菌完成亚硝酸氧化。

在伯杰氏细菌鉴定手册第 9 版[2]中将它们统归于硝化杆菌科9个属:硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化刺菌属(Nitrospina)、硝化球菌属(Nitrococcus)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)，硝化螺菌属Nitrospira 和亚硝化弧菌属Nitrosovibrio共 20种。

这些微生物广泛分布于土壤、湖泊及底泥、海洋等环境中。

除了上述专性化能自养微生物外, 有些异养微生物也能进行硝化作用。

如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) 、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) 、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis) [3] 等。

这些微生物可以在低碳条件下进行硝化作用，也可以在有机土环境中进行硝化作用。

此外,近年来还发现了厌氧氨氧化的现象, 并证明是一个生物过程,是由一些厌氧或兼性厌氧微生物在厌氧条件下完成的 ,这些微生物以NO3-或 NO2-为电子受体氧化氨获得生长所需能量，生长非常缓慢，最短的倍增时间也要 11 d。

迄今为止 ,虽然采取了各种办法, 但未能分离到厌氧氨氧化的纯培养物。

尽管如此，还是可以对厌氧氨氧化微生物进行富集和特性研究 ,采用荧光原位杂交技术( FISH)和16S rDNA PCR 扩增、序列测定, 证实了厌氧氨氧化微生物的存在,16S rDNA 序列同源性分析表明 ,它们是一群独特的原核生物[4]。

基于 16S rRNA 基因序列同源性(相似性)的系统发育分析表明,所有的自养氨氧化细菌(亚硝化细菌)系统发育比较单一,它们均属于变形菌纲( Proteobacteria)β亚纲和γ亚纲 ,其中属于β亚纲的亚硝化细菌又可以分为两个类群: 亚硝化单胞菌群(Nitrosomonas) ,包括欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)和运动亚硝化球菌(Nitrosococcus mobilis)；以及亚硝化螺菌群(Nitrososp ira) ,
包括所有的属于亚硝化螺菌属(Nitrosospira) 、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)和亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)的菌株,从进化距离看,这 3个属完全应归于 1个属[5]。

与亚硝化细菌不同,硝化细菌(亚硝酸氧化菌)的系统发育则要复杂许多,研究结果表明, 硝化细菌的4个属分属于不同的 4 个系统发育类型: 硝化杆菌属(Nitrobacter)属于变形菌纲的α亚纲, 硝化刺菌属(Nitrospina)属于β亚纲、硝化球菌属(Nitrococcus)属于γ亚纲，硝化螺菌属(Nitrospira)属于硝化螺菌门( phylum Nitrospira)[6]。

以上这些充分说明了硝化作用微生物在进化上的系统发育起源的异源性。

2 硝化作用微生物的分子生态学研究
由于亚硝化细菌、硝化细菌或厌氧氨氧化菌的生长都非常缓慢，使得分离纯化较为困难, 从而影响了对这类微生物研究的深入,而这类微生物的生态作用及其重要性又是不言而喻的。

同时由于分子生物学技术的发展、进步以及在生态学研究领域的应用,为避开传统的培养技术直接对样品进行检测和研究开辟了崭新的途径。

有学者应用特异引物的 PCR 扩增方法,分析了水样中β-亚纲的氨氧化细菌,结果表明, 从南极等采集的样品均可扩增出 PCR 产物,特异性探针杂交表明, 所扩增的PCR 产物为氨氧化细菌的 16S rRNA 基因[7]。

说明了该亚纲氨氧化细菌分布的广泛性。

沉积物中氨氧化细菌的群落结构,表明氨含量和污染程度越高其氨氧化细菌含量也越高,DGGE（变性梯度凝胶电泳）和 16S rDNA 分析表明主要是亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)类群的增加。

Hastings 等[8] 应用MPN、PCR、核酸探针杂交等分子生物学技术对富营养化的淡水湖的氨氧化作用进行了季节变化的研究,表明夏天具有较强的硝化作用,水中的氨氧化细菌随季节有较大的变化，主要是一些耐氨浓度较高的亚硝化螺菌(Nitrosospira)增加了, 而底泥的氨氧化细菌随季节的变化不大。

3 硝化作用的机制及相关酶类
硝化作用是利用亚硝酸菌和硝酸菌将氨氮转化为硝酸氮的过程，该过程的微生物为好氧化能自养型微生物，利用氨氮、亚硝酸盐为氮源，CO32-、 HCO-、 CO2等作为无机碳源来获得能量。

其硝化过程的特征为：该过程是一个好氧的反应，且需要大量的氧气来完成；该反应过程中微生物生长率低，生物量浓度较低，且受环境条
件较敏感；硝化过程是一个产酸的反应，在反应过程中需要补充大量的碱来保证反应的顺利进行。

在专性化能自养硝化作用中, 反应是由亚硝化细菌和硝化细菌分别完成的，其限速步骤是亚硝化细菌进行的氨的氧化，因此亚硝化细菌在硝化作用研究中受到特别的关注。

首先在氨单加氧酶(AMO)的催化下将氨氧化成羟氨(NH2OH)，再经羟氨氧化还原酶(HAO)的催化下将羟氨氧化成亚硝酸(NH2-），进而由硝化细菌的亚硝酸盐氧化还原酶催化形成硝酸(NH3-)。

而在厌氧氨氧化细菌中的情况则较为复杂，首先是亚硝酸被还原为羟氨, 然后一分子氨和一分子羟氨在类氨单加氧酶的催化下被氧化为肼(N2H4), 进而在类羟氨氧化还原酶的催化下被氧化为氮气[10]。

反应过程涉及的酶类：氨单加氧酶( ammonia monooxygenase, AMO) 羟氨氧化还原酶( hydroxylamine oxidoreductase, HAO），亚硝酸盐氧化还原酶( nitrite oxidoreductase, NOR），类氨单加氧酶( ammonia monooxygenase-like enzyme），类羟氨氧化还原酶( hydroxylamine oxidoreductase-like enzyme)。

4生物脱氮在污水治理中的应用
微生物脱氮原理
微生物脱氮的过程基本上可以总结为三个过程: 氨化作用，即将有机氮化合物转化为氨氮的一个过程硝化作用，可将氨态氮转化为硝态氮，是专性化能自养菌(亚硝化和硝化)以及异养氨氧化菌进行的硝化作用方式反硝化，在厌氧或兼氧条件下以硝酸氮为电子受体，最终还原为氮气或者氮的其他气态形式，此过程是厌氧氨氧化菌进行的硝态氮的还原过程[9]。

从反应机理来看，硝化过程仅改变了废水中氮素的存在形式，反硝化作用才是真正的脱氮过程。

因此完整的氨氮去除过程需要在好氧条件下进行硝化处理，在厌氧条件下进行反硝化处理。

传统生物脱氮工艺
生活污水中含有大量的有机氮和氨氮，当污水中的有机物被生物降解氧化时其中的有机氮被转化为氨氮。

活性污泥法是应用最早的生物脱氮技术，是利用氨化、硝化和反硝化最为典型的污水处理技术。

主要构筑物为曝气池、硝化池、反硝化池和沉淀池，在曝气池中进行氨化作用和有机物的降解，然后在硝化池中氨氮在亚硝化菌和硝化菌的作用下转化为亚硝酸氮和硝酸氮，在反硝化池中最终转化为氮气；该工艺分别在各自的构筑物中进行脱氮反应，反应速
度快且彻底，脱氮效果非常好，但是其存在的缺点是工艺流程长、所需构筑物多、投资高等[11]。

同步硝化反硝化脱氮工艺
传统的研究结果表明硝化反应和反硝化反应所需的环境不同，它们不能在同一个结构单元中共同实现。

但随着对两类细菌及脱氮工艺的深入研究，发现在好氧状态下污水中有30%的总氮会被去除，这和传统的理论截然不同。

再进一步的研究发现，在好氧的环境中也存在反硝化的现象，其存在着一种好氧反硝化的细菌。

随着同步硝化反硝化理论的出现，在一些污水处理工艺中也发现了类似的现象。

目前对该理论的解释有三种：（1）环境理论：研究这认为在好氧的构筑物中，曝气的不均匀，在环境中局部出现了缺氧、厌氧和好氧的环境，因此在工艺运行过程中，会在局部出现适合反硝化反应的条件。

（2）微观环境理论：该理论主要是针对颗粒污泥形式的微观环境，研究着认为在大于100μm的颗粒污泥中，在颗粒中回形成内部缺氧或厌氧的环境，进而在颗粒外部进行硝化反应，在内部进行反硝化作用，因此，可实现同步硝化反硝化。

（3）微生物理论：认为存在好氧环境进进行反硝化的细菌，即好氧反硝化菌。

在好氧环境中硝化菌和好氧反硝化菌相互协作，实现了同步硝化反硝化[12]。

结论：
微生物脱氮在目前以及未来具有广阔的应用前景。

虽然在这方面国内已经进行了大量研究工作，在实际应用过程中不但就其微生物群落功能展开研究，同时要考虑到水动力学和生物工艺学包含的广泛的科学基础知识，优化处理方案的能力也是至关重要的，同时要应该加强不同学科之间的交叉与合作,从工程应用、生态学及微生物学等角度加大力度进行研究，争取有所突破, 在环境治理上取得重大进展。

参考文献：
[1] 周德庆．微生物学教程［Ｍ］．北京：高等教育出版社.．
[2] Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Stalely JT, Williams ' s Manual of Determinative Bacteriology［J］.9th :The Will iams and Wilkins Company, 450.
[3] 张光亚，方柏山，闵航，等．好氧同时硝化－反硝化菌的分离鉴定及系统发育分析［J］．应用与环境生物学报， 2005,11(2)：226-228.
[4] 刘志培刘双江.硝化作用微生物的分子生物学研究进展［J］.应用与环境生物学报.2004,10( 4): 521-525.
[5] Head IM , Hiorns D, Embley TM , McCarthy AJ, Saunders phylogeny of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria as determined by analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences［J］. J Gen Microbiol, 1993, 139.
[6] Bock E, Koops genus Nitrobacter and related genera. In Balows A, Trǜper HG, Dworkin M , et al ed. The Prokaryotes［J］. 2nd ed. New York:Springer Verlag, 1992.
[7] Voy tek MA, Ward of ammonium-oxidizing bacteria of the beta -subclass of the class proteobacteria in aquatic samples with the PCR ［J］.Appl Environ Microbiol, 1995, 61( 4).
[8] Hastings RC, Saunders JR, Hall GH, Pickup RW, McCarthy AJ. Appl ication of molecular biological techniques to a seasonal study of ammonia oxidation in a eutrophic freshwater lake［J］.Appl Environ Microbiol, 1998 , 64.
[9] 黄秀梨.微生物的硝化作用和反硝化作用［J］.
[10] Arp DJ, Sayavedra-Soto LA, Hommes biology and biochemistry of ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea ［J］.Arch Microbiol, 2002, 178:250-255.
[11] 于佳馨，吴凡杰，杨小亮，等.废水处理中活性污泥法应用探析［J］.绿色科技2016年１月，第二期.
[12] 边春捷 .污水处理中生物脱氮工艺的研究进展 .资源节约与环保［J］. 2016 年第 4 期.。