抗体FITC标记操作流程记录

1.目的

规范单克隆抗体标记荧光FITC (快速标记法）标准操作程序

2.适用范围

适用于本公司抗体标记荧光FITC (快速标记法）操作

3.术语和定义

单克隆抗体采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)。其标记原理: FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加（异）硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记。

4.职责和权限

实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。

5.实验试剂.

5.1溶液配制

0.01mol/L PBS溶液配制

0.01 mol/L Phosphate Buffered Saline，pH 7.40

试剂名称配方量批号用量

Water 1L

NaCl（MW 58.44）0.799g

KH2PO4（MW 136.09）0.2g

KCl（MW 74.55）

0.2g

Na2HPO4·12H2O

2.89g

（MW 358.14）

调节pH 7.40后，加水定容至1.0L，再调节pH至7.40，过滤备用。

Storage Buffer，pH 7.40

试剂名称配方量批号用量

0.01mol/L PBS /

BSA 0.5%

NaN3

0.1%

调节pH 7.40后，加水定容至1.0L，再调节至pH 7.40。

5.2其他试剂

试剂名称厂家批号

活化液（modifier）

淬灭剂（quencher）

FITC荧光素

6.操作流程

6.1抗体活化

将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。

6.2与FITC反应形成共轭物

将抗体混合液（步骤6.1）加入mg FITC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。

6.3荧光淬灭

向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。淬灭开始时间：至结束时间：。

6.4透析

PBS中4度避光透析，3小时换液一次，连续透析8小时。或者PBS中4度避光透析过夜后换液一次，继续透析三小时。

6.5保存

收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。