DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用

收稿日期:2005-01-12
基金项目:山东省自然科学基金(Y002D01)和山东农业大学博士基金资助课题。

作者简介:石运庆(1976-),男,硕士,主要从事作物遗传育种研究。

*作者为通讯作者。

文章编号:1002-4026(2005)02-0022-08*综述*
DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用
石运庆,牟秋焕,李 鹏,刘保申
*
(山东农业大学农学院,山东泰安271018)摘要:本文总结了三类DNA 分子标记:(1)以Southern 杂交为基础的分子标记;(2)以PCR 为基础的分子标记;
(3)以串连重复的DNA 序列为基础的分子标记。

综述了这几类分子标记在作物品种鉴定与绘制指纹图谱,基
因定位与辅助选择育种,杂种优势群的划分与杂种优势的预测和细胞学研究等方面中的应用现状。

关键词:作物;DNA 分子标记
中图分类号: S503.2 文献标识码:A
伴随着遗传学的发展,遗传标记(genetic marker)经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA 分子标记四个阶段,其中DNA 分子标记诞生于上世纪80年代中期,与其他遗传标记相比,它具有如下优点:(1)直接以DNA 的形式表现,在生物各个组织,各个发育时期都可检测到,不受季节、环境限制;(2)数量极多,遍及整个基因组;(3)多态性高,并且自然存在许多的等位变异,不需专门创造特殊的变异材料;(4)表现/中性0,即不影响目标性状的表达,与不良性状也没有必然的连锁;(5)许多分子标记表现为共显性(codomainance),能够鉴别纯合基因型与杂合基因型,提供完整遗传信息。

分子标记的这些优点,在作物遗传育种的研究与应用中得到了广泛的体现。

1 DNA 分子标记
随着分子生物学的发展,相继出现了多种DNA 分子标记。

这些种标记大多以电泳谱带的形式表现,根据它们所用的技术不同,大致分为以Southern 杂交技术为基础的分子标记和以PCR 技术为基础的分子标记。

另外,由于其中有些DNA 标记和重复序列密切相关,所以就把它们单独列为一类,以突出其独特性。

1.1 以Southern 杂交为基础的分子标记
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)是Grodzicker 在1974年提出的。

其基本原理是由于酶识别序列内的点突变或部分DNA 片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位点的缺失或获得,导致限制性位点改变,再利用限制性内切酶切割DNA 时,就产生了大量的多态性片段。

基本操作步骤:DNA 的纯化、酶切、凝胶电泳分离DNA 片段、转膜、利用放射性同位素标记的DNA 探针进行Southern 杂交并放射自显影和结果分析。

RFLP 标记具有共显性特点,可以区别纯合基因型与杂合基因型,能够提供单个位点上较完整的资料。

结果稳定可靠、重复性好,特别适合于连锁图谱的建立,如小麦的RFLP 连锁图揭示了在小麦进化过程中,有多条染色体发生过易位[1],如7B S 上一个片段和5AL 上一个片段易位到4A 上,4AL 片段易位到5A 上,而第18卷 第2期
2005年6月
山东科学S HANDONG SCIENCE Vol 118 No 12Jun 12005
5AL 末端一个片段易位到7B S 上,6BS 末端易位到2BS 末端。

以前人们通过小麦非整倍体等研究表明,小麦
A 、
B 、D 三基因组的功能有相同之处,可以相互补偿。

现代RFLP 连锁图则进一步证明,这三个基因组之间基因数目以及基因在染色体上的排列位置都非常一致。

但是由于RFLP 标记对DNA 需要量较大(5~10L g ),所需仪器设备较多,检测步骤多,技术较复杂,周期长,成本高,还需要同位素标记,所以其应用受到了一定程度的限制。

1.2 以PCR 为基础的分子标记
1.2.1 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)
RAPD 是1990年Willia ms 和Welsh 发明的一种较为简便的检测DNA 多态性的技术。

它以一个随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基)作引物,通过PC R 对基因组DNA 进行随机扩增,产生大小不同的DNA 片段,再经凝胶电泳分开,进行多态性观察。

RAPD 图谱间的差异可因4种方式产生:¹核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配;º某个引物结合位点缺失;»两引物结合位点间的大片段插入导致间距过大而扩增中断;¼插入或删除改变了扩增产物的大小。

与RFLP 相比,RAPD 方法简便,快速,灵敏度高,DNA 用量少,且不需要同位素标记,安全性好。

RAPD 结果可以提供足够的多态性以分辨种以下的类型[2]。

Nguyen 等[3]利用40个RAPD 引物对15个小麦品种遗传多样性进行了分析。

海林等[4]利用RAPD 标记分析了小麦耐盐种质的遗传多样性,共产生200条扩增片段,多态性片段数为172条,扩增片段的多态性百分率为86%,供试的24份材料相似系数在0.21~0.97之间。

但是RAPD 技术因使用的引物比较短,对反应条件极为敏感,稍有改变便影响扩增产物的重现,重复性较差,稳定性不好。

另外,RAPD 是显性标记,不能区分杂合型和纯合型,无法直接用于基因型分析。

这些不足在一定程度上也限制了它的应用。

1.2.2 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)
它的原理是基因组DNA 双酶切,经PCR 扩增后的限制性片段进行选择。

其基本步骤为:先用两种限制性内切酶(一种为6碱基内切酶,如EcoR Ñ,Pst Ñ等,另一种为4碱基内切酶,如Msel)对DNA 进行酶切,然后在酶切片段上连上一个接头(adapter),根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物,进行特异PC R 扩增,扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。

AFLP 结合了RFLP 和RAPD 的优点,稳定可靠,重复性好,方便快速,只需极少量的DNA 样品,不需要Southern 杂交,不需要预先知道DNA 的序列信息,而且绝大部分为显性标记,显示的多态性信息量也很高。

因而,非常适合于品种指纹图谱的绘制,遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。

Barrett 等[5]利用AFLP 技术评价适应于西北太平洋旱地生产的春、冬小麦代表品种的遗传多样性,结果表明AFLP 对小麦遗传多样性的研究来说是一种很有效的技术。

美国康耐尔大学的Blair 利用AFLP 技术评价54份水稻品种的遗传多样性,研究其系统发育和分类,并与同工酶生化标记及RFLP 标记比较,发现其结论一致,而且认为AFLP 对于研究水稻品种的遗传变异和构建基因图谱更为理想。

但这种方法需经多步操作,并且费用较高。

1.2.3 序列标志位点(Sequence -tagged sites,STS)
STS 技术是一种将RFLP 标记转化为PCR 标记的方法。

它通过RFLP 标记或探针进行DNA 序列分析,然后设计出长度为20个碱基左右的引物,对基因组DNA 进行PCR 扩增寻找多态性。

它的扩增产物是一段长几百bp 的特异序列,此序列在基因组中往往只出现一次,因此能够界定基因组的特异位点。

STS 标记的信息量大,多态性好,是共显性标记,能够鉴定不同的基因型。

张泽民等[6]利用RG 227的RFLP 标记转化的STS 标记对水稻F 1花粉不育基因座位S -c 进行了精细定位,认为RG 227STS 与S -c 紧密连锁,遗传距离为0.3cM,为S -c 座位的图位克隆提供了更加准确和简便的检测手段。

陈松柏等[7]利用STS 标
23第2期石运庆,等:DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用
24山东科学2005年记对小麦抗白粉病基因Pm4进行了定位,发现STS410与抗病基因Pm4紧密连锁,并认为STS410可用于小麦抗白粉病基因Pm4的分子标记辅助选择。

目前,STS标记也已经应用在了人类基因组物理图谱作图中。

开发STS标记需要测序,所需费用较高,但是一旦开发了适宜的引物,应用价值很大。

1.2.4序列特异性扩增区域(Sequence Charac terized Amplified Re gions,SC AR)
SCAR是在RAPD技术上发展起来的。

其方法是将目标RAPD标记克隆并进行末端测序,根据原RAPD 片段两端的序列设计特定引物(通常为24个碱基),对基因组DNA再进行PCR扩增分析。

SCAR标记是共显性遗传,与RAPD标记相比有更好的稳定性,更高的可重复性。

刘志勇等[8]利用SCAR 标记对小麦抗白粉病基因Pm21进行了分子鉴定和标记辅助选择的研究,并认为SCAR标记是稳定、准确、可靠的DNA分子标记,可以用于标记辅助选择。

邹继军等[9]利用RAPD标记转化成的SC AR标记SCS3620&580对62份大豆灰斑病抗感种质资源进行了研究,检测结果与RAPD标记检测结果一致,并认为SC AR标记兼具RFLP和RAPD的优点,在大豆灰斑病抗病育种中具有广泛的应用价值。

1.2.5酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences,C APS)
CAPS技术又称为PCR-RFLP。

所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。

其基本步骤是:先进行PC R扩增,PC R扩增产物用限制性内切酶酶切,电泳分析多态性。

与RFLP技术一样,C APS技术检测的多态性是酶切片段大小的差异。

在此基础上又发展出了dCAPS(derived C APS)技术,它是检测单核甘酸多态性的一种良好方法。

钱前等[10]利用CAPS分子标记对水稻脆性突变体基因fp1做了进一步定位,发现C524a与fp1遗传距离为0.4cM。

刘道峰等[11]利用C APS标记对水稻类病变突变体lmi进行了基因定位,发现lmi基因与标记C4135-10共分离,为克隆lmi基因奠定了基础。

1.3以串联重复的DNA序列为基础的分子标记
1.3.1简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSRs)
SSRs简单序列重复,亦称微卫星DNA(microsatellite DNA)是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记,它是一类短的串连重复序列基序(1~6个核苷酸)组成的简单重复序列,均匀的分布在整个真核生物基因组中,两边有保守的DNA序列。

SSRs标记的等位基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动引起的重复序列数目的变化,而不是单个碱基的突变、插入或缺失造成的,因而表现出高度的多态性。

SSRs是一种较理想的分子标记,它具有以下一些优点:¹多数为共显性遗传,可以检测纯合基因型和杂合基因型;º变异丰富,多态性高;»随机均匀地分布在整个基因组中;¼快速,可通过PCR迅速测定分析;½所需DNA量少,且对其质量要求不高,即使是部分降解的DNA样品也可以进行分析;¾技术难度低,实验成本较低;¿很多引物序列公开发表易在各实验室广为传播使用等特点。

因此,该技术一经问世,便很快在动植物的遗传分析中得到了广泛的应用。

Smith等[12]利用SSRs标记对58个玉米自交系进行了遗传多样性研究,其结果与RFLP标记和系谱分析基本一致。

袁力行等[13]研究认为SSRs标记与其他标记相比,具有最高的多态性信息量(PIC)。

刘峰等[14]选用5~7个多态性最高的微卫星标记作为引物,可以大大提高在大豆种质鉴定中的效率,并认为SSRs等位基因差异分析有可能用于确定不同起源大豆品种之间的关系。

目前, SSRs已广泛应用于遗传图谱的构建、比较基因组研究、遗传多样性分析和系统学研究之中。

然而,SSRs引物具有物种特异性,开发和合成新的SSR引物投入高、难度大。

通过构建SSR基因文库,筛选阳性克隆,测定新的SSR序列,设计位点特异性引物,是一个过程繁琐、工作量大、效率低且花费很大的工作。

这是造成目前农作物中SSR已知位点少的主要原因。

1.3.2 简单序列重复区间扩增多态性(Inter Simple Sequence Repeat,ISSR)
I SSR 是一种新型的分子标记,由Zietkiewicz 等于1994年创建。

它是根据植物中广泛存在SSR 的特点,利用SSR 本身设计引物,不需预先克隆和测序。

ISSR 引物通常为16~18个碱基,由1~4个碱基组成的串联重复序列和几个非重复的锚定碱基组成。

所以ISSR 标记检测到的是重复序列之间的片段,而不象SSR 标记检测的是重复序列。

与SSR 相比,其引物还没有物种特异性,可以和RAPD 一样用于各类植物研究。

Nagaoka 等[15]用ISSR 引物对小麦的研究表明,此类引物的分析结果与RFLP 分析结果一样可靠,并发现(AC)n 引物
能扩增出更多的多态性。

钱韦等[16]应用RAPD 和ISSR 标记对源于中国海南和云南20个居群的疣粒野生稻
的遗传多样性进行了检测,结果表明,中国的疣粒野生稻在物种水平的遗传多样性较低,其遗传变异主要存在于海南和云南两地之间。

Gilbert 等[17]和Yang 等[18]的研究表明,ISSR 对PCR 反应的敏感性低于RAPD,稳
定性优于RAPD 。

但是,ISSR
1.3.3 小卫星DNA
1980~1984年间,生物学家相继发现人体基因组中存在一些高度变异的位点,它的DNA 序列是由一个基本序列单位(11~60bp)重复排列而成,每一位点都有多个等位基因,由于它们所含基本序列单位的数目不同,因而表现出长度上的差异。

它具有以下特点:多位点性(即一个探针可同时检测到基因组中数十个位点的变异性)、个体专一性和组织稳定性,因此在亲子鉴定、基因作图、定向克隆和疾病机理的连锁分析等方面得到广泛应用。

2 分子标记技术在作物遗传育种中的应用
由于分子标记所表现出的极大优越性,所以在作物遗传育种中得到了广泛的应用,主要表现在以下几个方面。

2.1 品种鉴定与指纹图谱绘制
在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记,某一品种具有区别于其它品种的独特标记即一些特异的DNA 片段组合就称为该品种的/指纹0。

品种指纹图谱(finger -print)是鉴别生物个体之间差异的电泳图谱。

目前主要有两种指纹图谱,一种是较早研究的蛋白质电泳指纹图谱,另一种是90年代后发展起来的DNA 指纹图谱。

现在用于构建DNA 指纹图谱的分子标记主要有RFLP 、SSR 、AFLP 和RAPD 等。

与蛋白质电泳指纹图谱相比,DNA 指纹图谱具有多态性丰富、分辨率高、稳定性强等优点。

Akagi 等
[19]利用高度多变的含有(AT)n 的17个SSR 标记能区分开59个亲缘关系极近的粳稻品种。

Pre -vost 等[20]建立了34个马铃薯品种的SSR 指纹图谱,能快速有效地区别各基因型。

如果DNA 指纹图谱技术能进一步简化步骤,降低成本,实现自动化,它会在作物遗传育种中发挥更大的作用。

2.2 细胞学研究
分子标记技术在鉴定外源染色体片段和鉴定易位系、代换系等细胞学研究方面,有着广泛的应用。

普通小麦T .aestivum L.(2n=6x =42,AABB DD)是由A 、B 、D 三个部分同源性的染色体组组成的异源六倍体。

它的A 染色体组供体为乌拉尔图小麦T .urartu (2n=2x=14,AA)。

D 染色体由节节麦T .tauschii (2n=2x=14,DD)提供。

拟斯卑尔脱山羊草(Aegilo ps s peltoides ,SS)单独或与近亲共同提供了B 基因组。

原来的研究清楚地证明了普通小麦是由栽培二粒小麦T .dicoccum (2n=4x=28,AABB)和节节麦杂交加倍形成的。

而栽培二粒小麦是野生二粒小麦T .dicoccoides (2n=4x=28,AAB B)进化来的。

最近,时津霞等
[21]用SSR 分析发现野生二粒小麦的A 、B 染色体组与普通小麦的A 、B 染色体组不完全相同,二者既有一定的同质性,也有很大的差异。

另外,徐勇等[22]研究了用SSR 技术辅助鉴定小麦的缺体-四体方法。

2.3 基因定位与辅助选择育种
25
第2期石运庆,等:DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用
26山东科学2005年
2.3.1基因定位
利用分子标记对某一特定的DNA区域内的目的基因进行定位,进而获得目的的基因,用于种间或种内转移,也是分子标记应用于育种,创造新材料的重要手段。

作物的很多农艺性状为质量性状或数量性状。

质量性状基因的分子标记定位,需要构建目标性状的近等基因系(Near Isogenic Lines,NILs)或近等基因池(Near Isogenic Pools,NIPs),使成对的两系或两池仅在目标基因附近的染色体区段存在差异,而其它区域相同或相似,再用分子标记检测亲本和两系或两池,以筛选出有差异的分子标记,然后用分离群体如F2、B C1、DH和RIL群体对筛选出的分子标记与目标性状进行连锁分析,从而构建出目标基因的染色体局部分子图谱。

对于数量性状,传统的研究方法主要是采用数理统计,将控制某一性状的多基因作为一个整体进行研究,无法确定单个QTL的遗传效应及其所在的染色体位置。

1988年,Paterson等应用RFLP标记将番茄的几个QTL剖分成单个孟德尔遗传因子。

此后,QTL的遗传和定位在玉米、水稻、番茄、马铃薯、大麦和高粱等多种作物中取得了长足的进步。

Demeke等[23]利用NILs找到了一个与抗小麦腥黑穗病基因Bt10紧密连锁的RAPD标记。

汤继华等[24]用SSR标记将A619的恢复基因定位在玉米第8号染色体上,与引物bnlg2307连锁,遗传距离为12.3c M。

关荣霞等[25]用43个ISSR引物对T型小麦细胞质雄性不育恢复基因R f6进行了标记分析,找到了与R f6连锁的两个位点。

刘保申等[26]利用79对SSR引物对K型小麦细胞质雄性不育系恢复基因进行了定位,发现有4个引物(Xgwm11、Xgwm18、Xgwm264a和Xgwm273)与LK783的育性恢复基因有连锁关系,并认为它们可以用于K型小麦细胞质雄性不育系育性恢复基因的标记辅助选择。

小麦的籽粒硬度直接影响到小麦的烘烤品质和加工品质。

而籽粒硬度属于数量性状,是由多基因控制的,它的一个主效基因位于5DS上,4个单效基因分别位于2A、2D、5B、6D,另外3个微效基因分别位于5A、6D、7A上。

对于这样一个多基因控制的复杂性状,Sourdiler等[27]在线性模型中仅用3个RFLP标记就可以解释大约75%的遗传变异,因而使复杂问题的研究难度大大简化。

2.3.2辅助选择育种
利用分子标记不仅可以定位目标基因,也可以利用与目标基因紧密连锁的分子标记追踪目标基因,实现对目标性状的间接选择,这就是所谓的分子标记辅助选择(Molecular Marker Assisted Selection)。

与传统表型选择相比,它具有以下优点:¹对目标性状的选择不受基因表达和环境因素的影响;º可在早代和植株生长的任何阶段进行选择,大大缩短了育种年限;»在分离世代能够快速地鉴定植株的基因型,不受基因显隐性的影响;¼可以打破目标基因与不利基因的连锁。

Huang等[28]用分子标记将4个抗白叶枯病的基因(Xa-4、Xa-5、Xa-13和Xa-21)聚合在一起,培育水稻持久抗病品种。

2.4杂种优势群的划分与杂种优势的预测
20世纪末,育种家以不同时期杂交种中主要亲本所占的百分比对我国的玉米种质进行了研究,或通过种质系谱、地理来源分析对我国玉米自交系进行了初步的类群划分[29]。

也有学者以植株的某些性状的总配合力效应值为依据对自交系进行了分类[30]。

这些方法由于存在人工选择、遗传漂移的作用,系谱不完整、不确定和复杂性等问题,使遗传变异分析存在一定局限性。

分子标记技术的发展为评价玉米自交系遗传变异提供了新手段。

Mumm等[31]和Dubreuil等[32]成功地利用RFLP标记对欧洲和北美的常用玉米自交系进行了杂种优势群划分。

刘新芝等[33]利用RAPD标记首次对我国玉米自交系进行了杂种优势群划分。

袁力行等[13]利用RFLP、SSR、AFLP和RAPD4种标记技术将15个供试玉米自交系分为5个类群,并认为SSR和RFLP两种分子标记方法很适合进行玉米种质多样性的研究。

李新海等[34]利用SSR 标记将70份我国玉米自交系划分为6个类群,且结果与系谱分析相符合。

近年来,分子标记技术在小麦杂种优势群的划分中也有很大进展。

孙其信等[35]选用我国38个冬小麦
品种(系)和2个加拿大春小麦品种(系),利用RAPD 标记研究小麦杂种优势群,29个引物(占49%)扩增产物经凝胶电泳分离表现多态性,共扩增出168条带,78条带(46.6%)具有多态性。

倪中福等[36]选用我国22
份普通小麦,7份西藏半野生小麦及来自国外的17份斯卑尔脱小麦等共46份材料,用26个引物在46份材料间随机扩增出279条带,其中182条带(占65.2%)具有多态性,每个引物可扩增2~18条多态性带。

但是,目前用分子标记划分杂种优势群、预测杂种优势中也有很多问题。

杜金友等[37]用分子标记研究玉米遗传多样性时,发现有些材料的聚类结果与系谱不同,并认为产生差异的原因可能是由于分子标记分布于整个基因组中,有些在基因内部,有些则与基因,特别是与产量相关的基因不一定有关,而在传统划群中,依据系谱来源、配合力和杂种优势来划分,致使利用分子标记聚类的结果与系谱划分的结果有时不一致。

张志清等[38]在研究SSR 标记遗传距离与小麦杂种优势相关性分析时发现,除穗粒重外,各性状杂种优势与SSR 标记揭示的亲本遗传距离的相关性不显著,并认为用SSR 标记遗传距离难以直接预测小麦杂种优势。

3 展 望
分子标记是随着遗传学的发展而诞生的,在作物育种方面应用虽然仅有几十年时间,却显示了巨大的生命力。

分子标记辅助育种已成为作物育种的重要途径之一。

但是,目前分子标记在育种上的应用还有一定的局限性,主要包括以下几个方面:(1)目标基因的标记和育种工作往往分开进行,造成两项工作无法很好的衔接;(2)开发的分子标记数量较少,多数作物的遗传图谱的饱和度还不够,还需要构建更为精密饱和的遗传图谱;(3)作物的很多农艺性状都是多基因控制的数量性状,而分子标记对数量性状的精确定位还有较大差距;(4)还有待于建立自动化的分子标记实验程序,实现对大群体快速、准确的鉴别。

目前,分子标记辅助育种技术还不够成熟和完善,还不能脱离常规育种技术而单独使用,但是它对作物育种工作和其它相关领域研究的推动作用是显而易见的。

我们坚信以及分子生物学理论与技术的不断发展,随着新的更为经济有效的分子标记技术的出现,分子标记技术必将在作物遗传育种方面得到更广泛的应用。

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