蛋白质纯化技术(上)

蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>难溶蛋白的溶解方案
盐酸胍的使用浓度一般为6M至7M，如果体系中含有较 高浓度的盐酸胍，则不能用来制备电泳样品。 尿素一般使用浓度为8M，但是尿素在配制过程以及存放 过程中，会形成氰酸盐，氰酸盐会与氨基进行反应，在进 行严格的实验时，可以利用离子交换柱除去氰酸盐。 硫脲在水中溶解度比较大，一般使用浓度为2M~10M， 通常与尿素配合使用。但硫脲毒性比较大，可通过吸入、 皮肤而被人体吸收。 DMF（N，N二甲基酰胺）主要用来溶解小分子肽，与之 类似的还有DMSO、二氧杂环己烷。
（r,旋转半径，cm; N，转速，rpm）
沉降系数
每单位离心场的速度
S
u r 2
v t a
1S=10-13s
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细胞破碎
机械方法
搅拌、振动
研磨 压滤 超声
非机械方法
干燥
渗透压 冻融 酶
匀浆
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选择一个合适的pH条件对溶解蛋白是十分重要的，选 择pH时需要考虑的因素有：体系的兼容性、蛋白的溶解性、 蛋白的稳定性。
原则上讲，对于酸性蛋白，应该选择pH较高的体系去 溶解；反之，对于碱性蛋白，应该选择pH较低的体系去溶 解。 但是过酸或过碱都会造成蛋白质的水解或都活性的丧 失。
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链霉素：与DNA结合形成沉淀。 硫酸鱼精蛋白：带正电，可与DNA结合，主要用于生产疫苗中除去 NDA，也用于蛋白纯化中除去DNA，尤其是纯化DNA结合蛋白。 MnCl2：可与核酸一起形成核酸锰，但可以加强DNA与组蛋白结合。
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概 述
原材料的获取
预处理
细胞破碎 研磨 超声 渗透压 酶
蛋白溶解 酸、碱 醇 去垢剂 尿素
粗提 沉淀 相分离 分子筛 ……
精提 各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
保存 浓缩 保存状态 保存条件 保存期限
……
……
……
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a r
离心分离因数：
r Fr g
2
Fr=3500~50000 高速离心
Fr>50000 超速离心
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预处理
rpm与g的换算
RCF
r g
2
r(
2N 2 ) 60 1.118 10 5 r N g
化学渗透
表面活性剂 （Triton) 金属螯合剂 (EDTA) 变性剂(Urea)
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细胞破碎
酶破碎法
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蛋白的溶解
为了方便提取与分离目的蛋白，通常需 要把所有的蛋白（目的蛋白和杂蛋白）都 溶解在同一体系中，然后再根据它们在液 相中的不同性质而将它们进行分离与纯化。
细胞破碎
超声破碎
利用超声波进行细胞破碎时，体系中会产生自由基，它 可能破坏蛋白的结构，因此进行超声破碎之前，需可以 添加自由基清除剂，如还原型的GSH，也可以用氢气预 吹细胞悬浮液来缓和。
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细胞破碎
渗透压
溶液渗透压，简单的说，是指溶液中 溶质微粒对水的吸引力。溶液渗透压的大小 取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶 质微粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引 力越大，溶液渗透压越高；反过来，溶质微 粒越少，渗透压就低。渗透压与无机盐、蛋 白质的含量有关。在组成细胞外液的各种无 机盐离子中，含量上占有明显优势的是Na+ 和Cl-，细胞外液渗透压的90%以上来源于 Na+和Cl-。
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蛋白的溶解
清蛋白
可溶于稀盐、稀酸、稀碱。 可被饱和硫酸铵沉淀。 eg:白蛋白，卵清蛋白
组蛋白
溶于水和稀酸，但可被稀氨水 沉淀，分子中含His、Lys多。 eg:小牛胸腺组蛋白
球蛋白
不溶于水但溶于稀盐，可以被 半饱和的硫酸铵沉淀。 eg: IgG，肌球蛋白
A 19th century hand cranked laboratory centrifuge.
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预处理
粒子在离心场中的运动速度：
d u ( s 2 r 18
2
Fr≤3500 常速离心
2
离心加速度：
蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>温度条件
蛋白质在水中的溶解很大程度上取决于其本身的疏水性， 一般来说，温度越高，蛋白质的疏水性就升高。因此，大多 情况下优先考虑低温环境去溶解蛋白。另外，为了减小体系 中蛋白酶对目的蛋白的降解作用，最好也用低温。 但是有些 特殊的蛋白，对热稳定性非常好，此时如果采用高温溶解不 仅可以使非目标蛋白变性沉淀，还可以去掉蛋白酶的干扰。 另外，如果蛋白的浓度比较高，则体系很容易析出晶体； 反复冻融蛋白质，也会使蛋白在体系中形成聚集沉淀。
10、有些离子或去垢剂会对蛋白质定量实验产生较大干扰，如Triton X-100在280nm处有吸收峰， Hepes会干扰Lowry法定量，大部分去垢剂都会干扰Bradford测定。
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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>pH条件
大的液体难以产生空化泡 。
-液体的温度：液体温度越高，对空化的产生越有利，但是温度过高时，气泡中蒸汽压增
大，因此气泡闭合时增强了缓冲作用而使空化减弱。 -探头的材料与形状 功率恒定时，探头的振幅与面积成反比。钛是最好的探头材料。
-处理量 大体积的处理对象需要更大的功率。
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细胞破碎
超声破碎 频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。 超声破碎的原理——空化作用 当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈振动，会在 液体内部产生小空洞。这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微 粒之间发生猛烈的撞击作用，从而产生几千到上万个大气压的压 强。微粒间这种剧烈的相互作用，会使液体的温度骤然升高，起 到了很好的搅拌作用，从而使两种不相溶的液体（如水和油）发 生乳化，并且加速溶质的溶解，加速化学反应。这种由超声波作 用在液体中所引起的各种效应称为超声波的空化作用。
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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>体系的兼容
在选择溶解体系时，要充分地考虑到所采用的离子之间是否兼容，离子的种类以及离子浓 度是否和体系后来要加入的物质兼容。常见不兼容体系可考虑以下因素： 1、二价及以上阳离子在碱性体系中不能稳定存在，尤其是Fe2+、Mn2+、Ni2+等过渡金属离子。 2、如果体系中严格不能有二价离子影响，则调pH时不能选用KOH、NaOH。可用Tris。 3、磷酸盐、碳酸盐可以与二价及以上金属离子形成沉淀。 4、Tris、EDTA可以与二价金属离子形成络合物。柠檬酸盐可以与蛋白质形成金属复合物。 5、有的酶需要金属离子存在才能有活性，有些酶则在特定金属离子存在下完全失活。 6、有些特殊的离子需要用特殊的螯合剂才能络合，如邻二氮杂菲可以用来螯合Zn2+。 7、一些离子存在与去垢剂不兼容的情况，长链脂肪酸与二价阳离子可形成沉淀，如脱氧胆酸钠 在Ca2+、Mg2+溶液中就不能溶解，但其牛磺酸衍生物不会与二价阳离子形成沉淀。 8、当pH>8时，钠离子的存在会使脱氧胆酸钠CMC值变小。 9、Hepes等具有哌嗪基的试剂在溶液中会形成自由基，会干扰氧化还原缓冲体系。
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A Brief View of
Protein Purification
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概 述
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成 和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂 的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的 含量极低。 要把蛋白质从复杂的体系中分离出来， 同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧 失，显然是有相当难度的。
蛋白的溶解
面对的问题
杂质的去除
蛋白的稳定
溶解体系与条件
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蛋白的溶解
杂质的去除
脂类：离心：吸去浮在表面的脂类；
SiO2：待蛋白全部溶解完后吸附，再离心除去。 石油醚：比较适合固态蛋白中脂杂质的去除。
核酸：核酸酶：将核酸直接分解为核苷酸。
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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>离子条件
不同蛋白溶解所需要的离子条件是不相同的，一般根据需 要选择合适的离子种类及浓度。大部分水溶性蛋白均可溶在 0.02～0.05M 磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液，也可溶 于0.15M NaCl溶液中。但是少数蛋白溶解对离子浓度依赖性比较强，这 些性质也可以用来作为粗提的理论依据。如肌球蛋白在0.6M KCl中溶解度最大，偏离这一浓度则溶解度下降，利用这一性质 可将其与其它蛋白分开。胶原蛋白多在1M NaCl溶液中有较大 溶解度，NaCl浓度大于2.4M时，立即形成沉淀。
蛋白的溶解
金属离子螯合剂 EDTA，EGTA， 塔罗肽（马组链霉菌）
蛋白的稳定
天冬氨酸蛋白酶抑制剂 碘乙酸，PMSF， PepstaFra Baidu bibliotekin，云芝发酵物
苏氨酸蛋白酶抑制剂
Unknown
蛋白酶
巯基蛋白酶抑制剂 PMSF，TLCK， N-乙基顺丁烯二酰亚胺 TPCK，Antipain-HCL
丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF，AEBSF-HCl Aprotinin，Chymostatin Leupeptin
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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>难溶蛋白的溶解方案
对于难溶解的蛋白质，可以采用强的离液剂进行溶解。常用 的离液剂包括：
盐酸胍 DMF
尿 素 硫 脲
表面活性剂
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鱼精蛋白
溶于水及稀酸，不溶于氨水， 分子呈碱性。 eg:鲑精蛋白
谷蛋白
不溶于水、醇和中性盐溶液， 但溶于稀酸或稀碱。 eg:米谷蛋白
硬蛋白
不溶于水、稀酸、稀碱、盐。 有较强机械强度。 eg:角蛋白，胶原
谷醇溶蛋白
不溶于水及无水乙醇，但溶于 70-80%乙醇中。非极性侧链多 eg:小麦醇溶蛋白
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细胞破碎
渗透压
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细胞破碎
渗透压
直接低渗溶液处理
有机溶剂 （Benzene 、Methylbenzene ）
抗生素（Penicillin ） 改变细胞壁或者 细胞膜通透性
原材料的获取
动物 培养物
植物
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预处理
材料的收集
过滤 离心
颗粒化处理
剪切 研磨
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预处理
离心
离心是利用离心力，分离液 体与固体颗粒或液体与液体 的混合物中各组分的方法。
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细胞破碎
超声破碎 影响超声破碎的因素
-超声波强度：对于一般液体超声波强度增加时，空化强度增大，但达到一定值后，空化
趋于饱和。
-超声波振幅：振幅越大，效率越高。 -超声波频率：频率越低，在液体中产生空化越容易 。 -液体的表面张力与黏滞系数：液体的表面张力越大，越不易于产生空化 ，黏滞系数