游离锌离子形态学检测方法探究
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【摘要】目的:使用ivznsamg、znseamg、iznsamg、tsq荧光、zinquin荧光对海马苔藓游离锌离子进行染色和比较。方法 : ivznsamg:采用na2s溶液灌流的锌离子结合方式;znseamg:采用事先注射硒酸钠的体内锌离子结合方式;iznsamg:采用取动物新鲜组织浸泡在浸染液中的锌离子结合方式;以上三种方法处理后均采用相同的amg孵育显色。tsq、zinquin荧光 :均为新鲜组织取材,液氮处理后荧光下观察。结果:在小鼠海马,所有染色方法均能标记出苔藓纤维的染色,各种染色在苔藓纤维标记有细节上的差异。所有染色方法中特异性最高的是znseamg;但其敏感性相对较差。而ivznsamg的敏感性最高,而其特异性则相对较差。结论:本实验中使用的游离锌离子染色方法都能成功的对游离锌离子进行标记,而这些染色方法的特异性和敏感性各有不同,对染色细节的雕琢能力也各有不同,因此可以根据这些方法的各自特点在实验选取适合的方法。
【关键词】游离锌离子;n (6 methoxy 8 quinolyl) p toluene sulfonamide (tsq)荧光技术;金属自显影;zinquin荧光技术;苔藓纤维
keywords free zinc; n (6 methoxy 8 quinolyl) p toluene sulfonamide (tsq) fluorescence; amg (autometallography); zinquin fluorescence; mossy fiber
目前,检测锌离子的手段很多,其中检测细胞内外游离锌离子的形态学手段主要有两种,即金属自显影术(autometallography, amg)和;n (6 methoxy 8 quinolyl) p toluene sulfonamide (tsq)和zinquin锌荧光探针技术。timm创始了著名的硫化银染色法,该方法是将“物理显影”的知识转而应用到重金属组织化学上。“物理显影”是19世纪由一位摄影家发明的,并由liesegang作为一种组织化学工具应用到组织学中,目的是使在银盐中暴光的组织中的银颗粒放大。自从timm引入了“某些金属硫化物可以通过物理显影被银放大”的观念,许多科学家应用了这一方法,并试图改进这一技术,而且已经发现了新的可以被银放大的金属微晶。在20世纪80年代早期,timm的硫化银法是成功的锌特异性显示法[1]。同时,出现了硒技术,该技术可以在体内含锌神经元终末产生硒化锌和逆向轴突示踪含锌神经元[1-3]。由于人们对银放大过程的逐渐理解,在组织化学领域,'金属自显影术'逐渐替代了'物理显影'这一名词。amg技术也演化出多种类型的2价金属离子追踪技术[4]。但无论amg技术如何演化,其根本原理仍然是使用银颗粒对2价离子化合物进行包裹,并对2价金属离子信号进行放大进而进行观测。本实验采的硫化钠技术、硒技术就是从上述amg方法中演化而来[4]。此前,我们曾应用amg技术报道了锌离子在脉络丛、视网膜、脊髓、小脑等部位的分布情况[5-9]。海马是神经系统内含锌最多的通路之一[4],因此本实验采用海马做为锌离子染色的材料。
1材料与方法
1.1 实验动物及分组实验动物为cd 1小鼠10只,体重30~35g,雌雄不限,由中国医科大学实验动物部提供。根据五种不同的染色方法将动物分为5组,每组2只,分笼饲养,常规饮食。
1.2 主要试剂和药品 tsq荧光染色试剂(invitrogen);zinquin荧光染色试剂(日本,dojindo caboratories);乳化银(fluka);戊巴比妥钠(sigma);恒冷箱切片机(leica);双目光学显微镜(olympus)。
1.3 实验方法
1.3.1 amg浸染法(iznsamg) 实验动物2只,均用氯化钠肝素溶液〔9ml 0.9%氯化钠 + 1ml 肝素(500iu/ml)〕灌流30s,直接用250ml 3%的戊二醛固定液灌流15min。所有的溶液均用0.5m的索伦森磷酸盐溶液缓冲。迅速取脑组织,并将组织放在快速组织切片机上,切出1~2mm厚的切片,将切片浸入改良timm溶液中,即浸入含0.1%硫化钠和3%戊二醛的0.1m的索伦森磷酸盐缓冲液中,ph为7.4。将染缸置于震荡器上,保持4℃。72h后,将切片用0.1m
的磷酸盐缓冲液小心冲洗10min。用于光镜的:将切片放入30%蔗糖溶液中,直至切片沉到玻璃杯底部。将切片用co2冷冻后快速置于冰冻切片机上,降温至-17℃,切10μm切片,然后切片置于amg孵育液[1]内并在恒温(26℃) 振动水浴箱内孵育60min,常规脱水透明后,中性树胶封片,在光学显微镜下观察。
1.3.2 硒酸钠注射amg法(znseamg) 实验动物2只,首先动物预先注射0.1%硒酸钠30mg/kg,待动物奄奄一息濒死时腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉,暴露心脏,用蠕动泵经左心室灌注生理盐水及
2.5%戊二醛灌流,迅速取脑,然后将脑组织放入2.5%戊二醛固定液中后固定4~6h,然后置于30%蔗糖溶液中,直至组织块沉到玻璃杯底部。常规10μm冰冻切片机切片,然后切片置于amg孵育液[1]内并在恒温(26℃) 振动水浴箱内孵育60min,常规脱水透明后,中性树胶封片,在光学显微镜下观察。
1.3.3 硫化钠灌流amg法(ivznsamg) 实验动物2只,颈椎离断后,首先灌注0.3%硫化钠溶液10min大约150ml,然后灌注生理盐水10min大约150ml,最后灌注
2.5%戊二醛10min 大约150ml。迅速取大脑组织、2.5%戊二醛后固定3h。然后标本置于30%蔗糖液4℃冰箱保存过夜。次日,标本用恒冷切片机制备10μm的冰冻切片,切片置于amg孵育液[1]内并在恒温(26℃) 振动水浴箱内孵育60min,常规脱水透明后,中性树胶封片,在光学显微镜下观察。
1.3.4 zinquin荧光染色实验动物2只,过量麻药处死,迅速取脑,放入液氮中,10min 后,将脑组织放入冰冻切片机中,冰冻切片20μm,空气中晾干。冷丙酮固定10min,zinquin 荧光溶液(1∶50)孵育2h(避光),0.1m pbs冲洗3次各10 min(避光)。荧光显微镜观察,360nm紫外光激发。
1.3.5 tsq荧光染色实验动物2只,过量麻药处死,迅速取出大脑,放入液氮中,10min 后,将脑组织置于冰冻切片机中,冰冻切片20μm,空气中晾干。避光条件下,切片浸入4.5μm tsq溶液中孵育60~90s,然后用0.9%生理盐水冲洗60s。荧光显微镜观察,360nm紫外光激发。