蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)

1．2．1蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性

参照於新建[]的方法并稍加改进。

酶液提取：取0.5g左右预冷的水稻叶片(剪碎的去主叶脉的叶片)，加4 mL缓冲液A(50mmol ／L Tris—HC1，pH 7．0、10 mmol／L MgC12、2 mmol／L EDTA-Na2、20 mmol／L巯基乙醇、2％乙二醇)于预冷的研钵中冰浴快速研磨成糊状，倒入离心管中，在低温冷冻离心机上4℃ 10000 r／rmin离心30 min，所得上清液用于酶活性测定。

SS活性的测定：在总体积0.15 mL的反应介质(含50 mmol／L Tris—HCL，pH7.0、10 mmol ／L MgC12, 10 mmol／L果糖、3 mmol／L UDPG)中，加入100uL酶液，30℃水浴中反应10 min，加入2 mol／L NaOH 0.05mL，沸水煮10 min，流水冷却。再加入1．5 mL浓盐酸和0．5 mL 0．1％的间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10 min，冷却后于480nm处比色测定蔗糖的生成。活性单位以[蔗糖nmol／(g·min)，Fw]表示。

SPS活性的测定：在蔗糖合成酶反应体系中用10 mmol／L果糖-6-磷酸取代10 mmol／L果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法。活性单位以[蔗糖umol／(g·h)，Fw]表示。

药品配制（按100份）

酶液提取

1 配制缓冲液A---1000ml

200mmol／L Tris—HC1----500ml

200m mol／L Tris 12.1g----500ml蒸馏水，

200m mol／L HC1／L 8.36ml盐酸（37%）加水491.63ml水

将250 ml Tris+233.5 ml HC1，在此液中加入MgC12（分子量95.21，0.9521g），EDTA-Na2（含两个结晶水分子量372，g），巯基乙醇（分子量78，ml），乙二醇（分子量，ml），最后加蒸馏水定容到1000ml

2 配制缓冲液B---1000ml 5 ml

12.5ml Tris+11.65ml HCl，加入MgC12 0.0238g，果糖（259.19分子量，0.1296g），加入UDPG （Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27，19.1ug）,定容到25ml 容量瓶

12.5ml Tris+11.65ml HCl，加入MgC12 0.0238g，加入果糖-6-磷酸（304.1分子量，0.03041g），UDPG（Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27，19.1ug）,定容到25ml 容量瓶

3 . 2 mol／L NaOH 50ml 0.4g 定容至50 ml

4.0．1％的间苯二酚1g 999ml 蒸馏水

5．做蔗糖标准曲线

植物组织ATP酶活性测定

一、原理

ATP酶（adenosinetriphosphatase）可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，以供生物体进行各需能生命过程。它存在于生物细胞的多个部位，比如细胞质膜上，叶绿体类囊体膜上，对整个生命的维持有着重要的作用。在生物学研究中，常通过测定酶促反应释放的无机磷量或ATP的减少量以及pH变化等来测定ATP酶的活力。本实验通过测酶促反应过程中无机磷的释放量来测定叶绿体偶联因子ATPase的活力。偶联因子是分布在叶绿体类囊体膜表面的一种复合蛋白，它在光合作用能量转换反应中起重要作用。在正常情况下，膜上的偶联因子催化光合磷酸化反应（ATP合成）的速率很高，而水解ATP的活力是十分低的，但用二硫苏糖醇（DTT）、胰蛋白酶或较高温度等激活后，它水解ATP的活力可大大增加。因此，偶联因子的测定常用激活后的ATPase水解ATP的活力来表示。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜菠菜10g，洗净，去叶柄和中脉备用。

（二）仪器设备：1．分光光度计；2．水浴锅；3．照光设备（光源50，000Lx）；4．台式离心机。

（三）试剂：1. Tris-HCl缓冲液1mol/L（pH8.0）：称60.57g Tris溶于400ml蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.0，再加蒸馏水至500ml。2. 5mol/L 硫酸溶液：取27.8ml（比重1. 84）浓硫酸，慢慢加入到70ml蒸馏水中，冷却后定容至100ml。3. 10％硫酸钼酸铵溶液：称10g钼酸铵溶于100ml5mol/L 硫酸中。4. 硫酸亚铁－钼酸铵试剂：称5g硫酸亚铁，加入10ml硫酸钼酸铵，再加蒸馏水稀释到70ml，直至溶解为止（用前临时配制）。5. STN缓冲液，将0.05mol/L Tris-HClpH7.8缓冲液（内含0.4mol/L 蔗糖、0.01mol/L NaCl)放入冰箱中预冷。

三、实验步骤

（一）叶绿体制备及叶绿素含量测定：

取准备好的菠菜叶5g，置于研钵或组织捣碎机杯中，加入20ml0℃下预冷的STN缓冲液，很快研磨或捣碎（0.5min完成），作成匀浆，以四层纱布过滤去粗渣，滤液于0～2℃下，200×g离心约1min，去细胞碎片，将上清液再于1500×g离心5～7min，取沉淀悬浮于少量STN（pH7.8）中，使叶绿素含量在0.5mg/ml 左右。小麦、水稻均可以此介质制叶绿体。如以甜菜叶子作材料，则匀浆介质中还应加入0.02mol/L 抗坏血酸钠。一般取0.1ml叶绿体，加0.9ml水和4ml丙酮（分析纯），离心，取上清液于652nm测吸光度，按Arnon 公式计算：叶绿素含量＝A652×1000×5/(34.5×1000×0.1)＝A652×1.45mg/ml （二）ATP酶的激活：

1. Mg2+-ATP酶激活液及反应液配制

2. 激活过程：取已制备好的叶绿体悬浮液1ml（叶绿素含量约为0.1mg/ml），加入1 ml激活液，于室温在白炽光50000Lx下进行光激活6min。

3. 反应过程：取三只试管，分别加入上述激活后的叶绿体悬浮液各0.5ml（剩下的叶绿体悬浮液供测定叶绿素含量用），再加入0.5ml的反应液，取两管置37℃水浴中（另一管置冰浴中作空白用）保温10min，各加入0.1ml20％的三氯乙酸停止反应。用台式离心机离心后各取上请液0.3～0.5ml（取样量按活力小大而改变）供测定ATP水解的无机磷用。