第五章 动物细胞冷冻与保存

• （2）玻璃化冷冻方法 • ① 一步玻璃化冷冻：乙二醇+高分子聚蔗糖+渗透压 较高的蔗糖配成7.5mol/l浓度的EFS40，20℃条件下 镜胚胎直接装入含有玻璃化溶液的塑料细管中，平 衡2min后入液氮。 • ② 采用乙二醇或甘油以及乙二醇和DMSO为主体抗 冻保护剂配成EFS、GFS、EDT玻璃化溶液，在室 温20~25℃条件下，先将胚胎在10％乙二醇溶液中预 处理5min，然后移入上述玻璃化溶液的细管中，平 衡30s后将细管封口，入液氮。 • 解冻：空气中停10~15s，然后在20~25℃水浴解冻。
（三）复温速率
•
一般来说，复温速率越快越好，采用快速升 温的方法使细胞吸收水分，结构不受影响而复苏。 当复温速率在100℃/min以上时，对细胞的损伤 最小；当复温速率在0～10℃/min时，复温到50℃左右时，若不快速通过此温区，可引起冰的 再结晶，使细胞内原有的小冰晶重新结晶为大冰 晶，更加重了溶质损伤（盐害）。 • 方法：将冷冻细胞从液氮中取出，立即投入 到37 ℃水浴锅中融化即可。
• 渗透性：降低冰点,延缓结冰;提高质膜通透性,使水分 快速渗出,减少冰晶形成. • 非渗透性：在一定温度下，可使溶液结冰的部分缩 小，从而降低细胞内和外溶质的浓度。 • DMSO是目前最常用的冷冻保护剂，常温下对细胞 毒性作用较大，而4 ℃下其毒副作用大为减弱，因此冻存 时细胞在4 ℃ 下DMSO(5%-10%)中平衡40-60分钟。 DMSO无须灭菌处理，也不适合高压灭菌或滤膜过滤。
• 玻璃化冷冻 • 指高浓度的冷冻保护剂在快速降温过程中， 形成一种极其粘稠的、介于液体和晶体之间的 “玻璃态”，而无任何形式的冰晶形成，从而 避免了因结冰而导致的各种损伤。 玻璃化冷冻多在胚胎冷冻中使用。 • 不同种属及同一种属不同类型的细胞对冷 冻的敏感性不同，所以所需冷冻速率也不同。 绝大多数细胞的冷冻致死温度在-5～-60℃， 一般在-20～-40℃为致死敏感区域。
（二）生殖细胞的冷冻保存
• 1．精液的冷冻保存 • 精液第一次稀释用不含甘油的稀释液，在1小 时内降到0～5℃，之后用含甘油的稀释液进 行第二次稀释，平衡数小时后冻存： • （1）细管型 • （2）安瓿型 • （3）颗粒型 • 解冻：40℃解冻后维持在5~8℃输精。其危险 温区0~-60℃，最显著的有害温区-15~-25℃.
• 2．动物卵母细胞冷冻效果鉴定 • （1）显微镜观察，卵丘细胞未脱落，透明 带完整，胞质均匀； • （2）用于成熟培养或体外受精，进行受精 率、卵裂率等鉴定。
• （三）胚胎冷冻效果鉴定 • 1．形态鉴定 • 相差显微镜200倍下暗视野观察，存活的细胞呈 球形，透明度高，细胞膜光滑，胞质内有很少的 反光颗粒，有时可见较暗的细胞核。 • 2．染色鉴定 • （1）台盼兰染色鉴定： • （2）荧光染色： • 3．体外培养鉴定 • 4．实体检验
第五章 动物细胞冷冻与保存
• 一、冻存细胞的意义 1、长期保存细胞 2、防止细胞老化 3、实验本身的需要。
如单克隆抗体实验
二、细胞冷冻保存的原理
• 1. 冷冻对细胞器的影响（p168） • （1）生物膜：通透性改变；膜蛋白被释放， 并伴有酶的释放和失活；膜脂由液晶态排列转 为凝胶态排列。 • （2）线粒体：不能进行正常的物质代谢，得 不到正常的能量供应。 • （3）对酶的影响：酶失活
• ② 快速冷冻法 • 室温下，卵母细胞保护液中平衡0~10min后，移 入4℃预冷的最终浓度保护液中，装管，4℃下平 衡10-15min，再以-5℃~-7℃植冰，再以 0.1~1.0℃/min降温至-30~-40℃后投入液氮。 • 解冻速度以大于25℃/min速率进行。
• ③ 一步冷冻法 • 卵母细胞用冷冻保护剂处理后，在室温平 衡15min，采用慢速冷冻将其装入细管，然 后垂直放入预冷至0℃的钢筒内，平衡3min 以后，投入液氮。 • 解冻：0℃冰水中水浴解冻，在4℃10min内 去除保护剂，或在室温下用10min的时间脱 除保护剂。
六、细胞冻存的效果鉴定
• 不同细胞的生理、生化特点和结构不同，因此冻存 效果鉴定 方法也不尽相同。 • （一）体细胞冻存效果鉴定：染色体排斥试验 • （二）生殖细胞冻存效果鉴定 • 1．动物冷冻精液的冻存效果鉴定 • （1）精子活力≥0.3 • （2）精子顶体完整率：观察数目≥500个，顶体完整率 ≥40％ • （3）直线前进运动精子总数 细管型≥1000万个；颗粒型≥1200万个；安瓿型≥1500 万个
四、冷冻保护剂
• 1. 概念和分类 • 冷冻保护剂是指为了防止细胞在冷冻和 解冻过程中形成冰晶造成损伤而使用的某类 小分子或高分子化合物。 • 渗透性冷冻保护剂： DMSO、甘油、乙 二醇等小分子物质 • 非渗透性冷冻保护剂：蔗糖、抗冻蛋白 （antifreeze protein, AFP）等。
2. 冷冻保护剂作用机理
五、冻存程序
• （一）体细胞冻存过程 • 取对数期细胞（5×106个 /mL）→ 等体积20 ％DMSO/培养液，重悬 → 分装于冷冻管或安 瓿瓶中（0.5-1.5mL/管）→ 封 口 → 降 温（下 降温度控制在1℃ /分） • 不同细胞对冻存速度要求不同。 • 要适当掌握温度下降速度。 • 原则上细胞在液氮中可贮存多年。但为了稳妥 起见，冻存一年之后，应再复苏培养一次，然 后再继续冻存。
2.超低温冷冻保存
• （1）常规慢速冷冻 • 装管后于显微镜下确定后封管。以1℃/min 降温至-5~-7℃后植冰，平衡10min后温度 大约为－12℃，之后以0.3℃/min降温至－ 30~－40℃后入液氮。 • 解冻：常规冷冻保存的细管，胚胎由液氮 取出后在空气中停留10~15s，然后浸入室 温水或37℃水浴中解冻后，将胚胎移入等 渗生理溶液中洗净备用。
• 存在问题： • 卵母细胞体积大，不易充分脱水，并且冷冻 可造成卵母细胞结构严重受损。 • 卵母细胞对低温和抗冻保护剂的化学毒性的 耐受性较低， • 卵母细胞的冷冻保存一直未得早期胚胎的保存与冷冻
• • • • • • 1. 胚胎的低温保存法 （1）保存方法： 常温保存法：保存几小时到几天，无明显影响 0~10℃保存： （2）保存流程 培养液洗2遍，移入0.5mL小试管内，每管5~10枚， 用处理过的橡皮塞塞紧，从室温降到所需温度保 存。保存一定时间后，把试管直接放在室温或 37℃水浴升温至室温或37℃，转入37℃新鲜培养 液中，挑取活胚继续培养。
• （3）细胞的温度休克——低温损伤：一些 动物细胞如猪的卵子和胚胎，由于细胞质 内脂肪颗粒含量的不同，在10～20℃情况 下就可受到损伤。
• （4）冷冻使细胞正常功能破坏。
3. 保护机理
• （1）溶质效应可通过快速冷冻，缩短胞内 高渗状态持续的时间，使细胞膜脂质分子 的损伤降到最低。 • （2）冰晶损伤则可以通过以下方式减小： • ① 在冷冻前期使细胞内部充分脱水减少冰 晶形成； • ② 提高冷冻速率，使胞内水分在冷冻过程 中快速冷冻形成玻璃化状态，不形成冰晶。
• ④ 超快速冷冻法 • 卵母细胞用适当的冷冻保护剂混合液短暂处理后， 短时间平衡1~2min或不平衡，直接投入液氮。 • 缺点：受损大。 • ⑤ 玻璃化冷冻法 • 玻璃化溶液VS1[20.5%(m/V)DMSO，15.5%(m/V) 乙酰胺，10%(m/V)丙二醇，6%(m/V)聚乙二醇8000，pH8.0]处理5~10min，装管后立即投入液氮。 • 解冻：由液氮中取出，室温放置5s，投入37℃水浴 中20s解冻。用含0.5mol/L蔗糖的PBS室温处理 10min，一步脱除保护剂，用TCM199+10%FCS洗2 次，再培养、受精和移植。
2.卵母细胞的冷冻保存
• • • • • （1）卵母细胞的获取 （2）卵母细胞的分级与筛选 （3）冷冻方法 ① 慢速冷冻法 用TCM-199+5%(V/V)FCS洗2~3次，室温下冷冻平 衡液中20min，装入冷冻细管中，封口。以1℃/min 降温至-7℃时植冰10min，0.3℃/min降温至-30℃后， 以0.1℃/min降温至-80℃，投入液氮。 • 优点：细胞脱水完全，胞内不易形成冰晶。 • 缺点：非常费时，冷冻保护剂处理细胞时间过长。
2. 冷冻过程中的细胞损伤机理
• （1）化学损伤——溶质效应：指细胞降温过 程中，细胞外部溶液中的水先结冰，细胞内 的水渗出，使细胞内形成高渗环境，若降温 速度太慢，细胞长期处于高渗环境会使细胞 膜脂质分子受到损伤而渗漏，复温时水分大 量渗入胞内使细胞死亡。 • （2）物理损伤——冰晶损伤：指细胞内水分 随着温度的下降而形成冰晶，对细胞膜和其 他细胞器产生不可逆的机械性损伤的过程。
三、影响细胞冻存的因素
• （一）冷冻温度 • 1. －80℃左右保存：细胞代谢并没有完全 抑制，长期储存可发生变性变化，因此， 一般保存期不应超过2年。
• 2. 液氮保存（－196℃）：可长期保存。
• （二）细胞的冷冻速率 • 冷冻速率太慢，虽然能使胞内水分充分脱 出，有利于减少冰晶形成，但同时也会使 细胞严重脱水而失去活性。 • 冷冻速率快时，细胞内水分来不及外渗， 在冷冻过程形成冰晶对细胞造成物理损伤。 • 冷冻速率非常快时，会使胞内水分形成无 规则排列玻璃化状态，避免大的冰晶形成。 超快速冷冻是最为理想的冷冻方式。