第13章基因工程和基因组学
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第13章基因工程和基因组学
1
• 1971,美国史密斯,细菌,限制酶; • 1972,伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒DNA与λ噬菌体
DNA,用DNA连接酶连接,新的DNA分子; • 1973,科恩将重组外源DNA片段与质粒连接起来,重组质
粒,转入大肠杆菌; • 1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达; • 1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进
苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病.
第13章基因工程和基因组学
2
第一节
基因克隆所需要的酶
第13章基因工程和基因组学
3
一、限制性内切核酸酶
1、限制性内切核酸酶的发现和限制性—修饰现象
EcoRⅠ
限制作用
GAATTC CTTAAG
MEcoRⅠ 修饰作用
G AATTC CTTAA G
GAATTC CTTAAG
（1）DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素。
（2）酶切消化的缓冲液。
（3）酶切反应的温度。
（4）其他因素。反应的时间、消化过程中能否保持恒定 的体积（在混合物上覆盖一层矿物油来防止缓冲液中的水 分散失）
（5）部分消化和过消化。
第13章基因工程和基因组学
11
8、限制性内切核酸酶在生物技术中的 运用。
（3）：在同一种菌株中分离获得的不同内切酶按照分离时间 的先后以罗马数字加以标注。
来自流感嗜血菌的几种第不13章同基的因工限程和制基因性组内学 切核酸酶就用HindⅠ10 、 Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ等表示。
7、影响限制性内切核酸酶的一些因素 和实际工作中采用的方案。
限制性内切核酸酶试剂盒，都提供了酶切优化配方。
限制性内切核酸酶在基因克隆中就象外科医生的手 术刀。
（1）构建重组的DNA分子。
（2）探针的制备。
（3）DNA物理图谱的构建。
（4）DNA甲基化的分析
第13章基因工程和基因组学
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二、DNA聚合酶
DNA聚合酶的重要特性是将脱氧核糖核酸连续地连 接到双链DNA分子的3`-OH末端，催化核苷酸的作用， 形成长链的核酸分子。依据DNA聚合酶的作用和来 源不同，可分为以下同种：
入市场; • 1985,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功; • 1986,基因工程生物实验性地释放到环境中; • 1990~1992,头一个转基因小麦,玉米; • 1994,基因工程西红柿在美国上市; • 1996,克隆羊多利诞生. • 现在,利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品,疫
（3）： 切割和修饰功能由两种不同的酶催化所完成；
（4）： 切割不需要ATP和SAM作为活性催化因子。
第13章基因工程和基因组学
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例如：
EcoRⅠ;HindⅢ;BamHⅠ;Pst Ⅰ;Xho Ⅰ（黏性末端） Sma Ⅰ;Xma Ⅰ （平头末端） Sfi MboⅡ;Hph Ⅰ
5`-GAATTC-3` 3`-CTTAAG-5`
基因克隆载体必备的一些基本条件： （1）1个或多个克隆位点。 （2）携带外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够
进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随 着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。 （3）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。 （4）载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因， 对于细胞的生长不会产生显著的影响。
5`-G-3` 3`-CTTAA-5`
5`-AATTC-3` 3`-G-5`
EcoRⅠ切割双链DNA产生5`突出的黏性末端
5`-CCCGGG-3` 3`-GGGCCC-5`
5`-CCC-3` 3`-GGG-5`
5`-GGG-3` 3`-CCC-5`
SmaⅠ切割双链DNA产生5`突出的平头末端
第13章基因工程和基因组学
ห้องสมุดไป่ตู้特点：
1kb左右距离进行随机切割，70个左右的核苷酸，基 因工程中运用极为有限
第13章基因工程和基因组学
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3、Ⅱ型限制性内切核酸酶
2300多种，可识别230多种不同的DNA序列，基因工程中 运用十分广泛。
特点：
（1）： 能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位 点通常是具有双链回文对称的结构；
（2）： 切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补并能 够重新连接；
第13章基因工程和基因组学
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6、限制性内切核酸酶的命名和分类
几条基本原则：
（1）：利用属名的第一个字母和种名的前2个字母代表内切 酶的来源。
Escherichia coli,Eco;Haemophilus influenzae,Hin;
（2）：内切酶的第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。
EcoRI中的R就表示该内切酶来自于大肠杆菌的R菌株, 如果还 不足以说明，有些情况下还加上数字1或2来表示例如EcoR1 等。
EcoRⅠ
//
限制性内切核酸酶Eco第R1Ⅰ3章和基因甲工基程化和转基因移组酶学进行限制和修饰作用图解 4
2、Ⅰ型限制性内切核酸酶
EcoB：
识别序列 T-G-A-（N）8-T-G-C-T；甲基化的位点 第 3或第9腺嘌呤
Ecozk：识别序列 A-A-C-（N）6-G-T-G-C；甲基化 的位点 目前还不清楚
第13章基因工程和基因组学
（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow酶和T4 DNA聚合酶 （2）Taq DNA聚合酶 （3）RNA反转录酶 （4）末端转移酶 （5）DNA连接酶 （6）碱性磷酸化酶 （7）其他种类的核酸化酶类
第13章基因工程和基因组学
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第二节
基因克隆所需要的载体
第13章基因工程和基因组学
14
在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外 源的DNA片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片 段DNA分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的 DNA分子称为基因克隆载体。
7
4、Ⅲ型限制性内切核酸酶
与Ⅰ型极为相似，EcoP 1 EcoP 1 5，运用极为有限。
特点：
（1）：具有特异的识别位点，这种识别位点是非 对称的；
（2）：切割位位点通常位于识别位点的3`一侧25 个碱基处进行单链切割DNA分子；
第13章基因工程和基因组学
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5、其他限制性内切核酸酶
目前还发现了一些识别特殊碱基序列的限制性内切核 酸酶，如在大肠杆菌中发现识别羟甲基胞嘧啶、5-甲 基胞嘧啶和4-甲基胞嘧啶DNA分子的限制性内切 酶,McrBC。
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• 1971,美国史密斯,细菌,限制酶; • 1972,伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒DNA与λ噬菌体
DNA,用DNA连接酶连接,新的DNA分子; • 1973,科恩将重组外源DNA片段与质粒连接起来,重组质
粒,转入大肠杆菌; • 1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达; • 1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进
苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病.
第13章基因工程和基因组学
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第一节
基因克隆所需要的酶
第13章基因工程和基因组学
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一、限制性内切核酸酶
1、限制性内切核酸酶的发现和限制性—修饰现象
EcoRⅠ
限制作用
GAATTC CTTAAG
MEcoRⅠ 修饰作用
G AATTC CTTAA G
GAATTC CTTAAG
（1）DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素。
（2）酶切消化的缓冲液。
（3）酶切反应的温度。
（4）其他因素。反应的时间、消化过程中能否保持恒定 的体积（在混合物上覆盖一层矿物油来防止缓冲液中的水 分散失）
（5）部分消化和过消化。
第13章基因工程和基因组学
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8、限制性内切核酸酶在生物技术中的 运用。
（3）：在同一种菌株中分离获得的不同内切酶按照分离时间 的先后以罗马数字加以标注。
来自流感嗜血菌的几种第不13章同基的因工限程和制基因性组内学 切核酸酶就用HindⅠ10 、 Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ等表示。
7、影响限制性内切核酸酶的一些因素 和实际工作中采用的方案。
限制性内切核酸酶试剂盒，都提供了酶切优化配方。
限制性内切核酸酶在基因克隆中就象外科医生的手 术刀。
（1）构建重组的DNA分子。
（2）探针的制备。
（3）DNA物理图谱的构建。
（4）DNA甲基化的分析
第13章基因工程和基因组学
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二、DNA聚合酶
DNA聚合酶的重要特性是将脱氧核糖核酸连续地连 接到双链DNA分子的3`-OH末端，催化核苷酸的作用， 形成长链的核酸分子。依据DNA聚合酶的作用和来 源不同，可分为以下同种：
入市场; • 1985,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功; • 1986,基因工程生物实验性地释放到环境中; • 1990~1992,头一个转基因小麦,玉米; • 1994,基因工程西红柿在美国上市; • 1996,克隆羊多利诞生. • 现在,利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品,疫
（3）： 切割和修饰功能由两种不同的酶催化所完成；
（4）： 切割不需要ATP和SAM作为活性催化因子。
第13章基因工程和基因组学
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例如：
EcoRⅠ;HindⅢ;BamHⅠ;Pst Ⅰ;Xho Ⅰ（黏性末端） Sma Ⅰ;Xma Ⅰ （平头末端） Sfi MboⅡ;Hph Ⅰ
5`-GAATTC-3` 3`-CTTAAG-5`
基因克隆载体必备的一些基本条件： （1）1个或多个克隆位点。 （2）携带外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够
进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随 着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。 （3）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。 （4）载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因， 对于细胞的生长不会产生显著的影响。
5`-G-3` 3`-CTTAA-5`
5`-AATTC-3` 3`-G-5`
EcoRⅠ切割双链DNA产生5`突出的黏性末端
5`-CCCGGG-3` 3`-GGGCCC-5`
5`-CCC-3` 3`-GGG-5`
5`-GGG-3` 3`-CCC-5`
SmaⅠ切割双链DNA产生5`突出的平头末端
第13章基因工程和基因组学
ห้องสมุดไป่ตู้特点：
1kb左右距离进行随机切割，70个左右的核苷酸，基 因工程中运用极为有限
第13章基因工程和基因组学
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3、Ⅱ型限制性内切核酸酶
2300多种，可识别230多种不同的DNA序列，基因工程中 运用十分广泛。
特点：
（1）： 能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位 点通常是具有双链回文对称的结构；
（2）： 切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补并能 够重新连接；
第13章基因工程和基因组学
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6、限制性内切核酸酶的命名和分类
几条基本原则：
（1）：利用属名的第一个字母和种名的前2个字母代表内切 酶的来源。
Escherichia coli,Eco;Haemophilus influenzae,Hin;
（2）：内切酶的第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。
EcoRI中的R就表示该内切酶来自于大肠杆菌的R菌株, 如果还 不足以说明，有些情况下还加上数字1或2来表示例如EcoR1 等。
EcoRⅠ
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限制性内切核酸酶Eco第R1Ⅰ3章和基因甲工基程化和转基因移组酶学进行限制和修饰作用图解 4
2、Ⅰ型限制性内切核酸酶
EcoB：
识别序列 T-G-A-（N）8-T-G-C-T；甲基化的位点 第 3或第9腺嘌呤
Ecozk：识别序列 A-A-C-（N）6-G-T-G-C；甲基化 的位点 目前还不清楚
第13章基因工程和基因组学
（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow酶和T4 DNA聚合酶 （2）Taq DNA聚合酶 （3）RNA反转录酶 （4）末端转移酶 （5）DNA连接酶 （6）碱性磷酸化酶 （7）其他种类的核酸化酶类
第13章基因工程和基因组学
13
第二节
基因克隆所需要的载体
第13章基因工程和基因组学
14
在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外 源的DNA片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片 段DNA分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的 DNA分子称为基因克隆载体。
7
4、Ⅲ型限制性内切核酸酶
与Ⅰ型极为相似，EcoP 1 EcoP 1 5，运用极为有限。
特点：
（1）：具有特异的识别位点，这种识别位点是非 对称的；
（2）：切割位位点通常位于识别位点的3`一侧25 个碱基处进行单链切割DNA分子；
第13章基因工程和基因组学
8
5、其他限制性内切核酸酶
目前还发现了一些识别特殊碱基序列的限制性内切核 酸酶，如在大肠杆菌中发现识别羟甲基胞嘧啶、5-甲 基胞嘧啶和4-甲基胞嘧啶DNA分子的限制性内切 酶,McrBC。