组织学技术的基本理论和技术

组织学技术的基本理论和技术

组织制片分类

一、超活体染色制片二、活体染色制片三、分离制片法四、涂片法五、印片法六、整装片七、磨片法八、切片法九、血管注射法十、整装切片法

组织制片技术及其神经组织的制片技术

一、动物麻醉法1.乙醚吸入麻醉法2.戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法3.空气栓塞4.直接杀死法

二、动物取材（一）动物选择（二）组织取材的方法

神经系统的取材1.脊髓2.神经纤维3.大脑和小脑

三、固定和固定液

（一）固定的目的和意义:

目的：

1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。

2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。

3、使组织硬化，便于切块。

4、对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。

5、保存好大体标本。

6、可增强染色的作用

意义：

组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

（二）固定的方法1.小块组织固定法2.局部组织固定法3.整体注射固定法4.蒸汽固定法三、固定和固定液

（三）组织固定与温度的关系

Bernard经过一系列的研究后认为，肝、肾、肺的最佳固定温度是70℃，和77℃，因为各种组织的结构不同，成分不一，电子密度不一样，因而固定所需要的温度也不样。我们的实验认为，65℃左右的温度可适合于各种组织，条件是固定取小块材料，时间在截取3-4min。（四）固定应注意的问题

1、组织固定越新鲜越好。

2、组织固定，组织块不宜过大。

3、对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。

4、组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。

5、固定液的量要充分。

6、特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。

7、组织的第二次固定或后固定。

（五）固定液：固定液必须具备的性能：固定液必需要有较强的渗透能力，能迅速地渗入组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶性物质，能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。

固定液的分类

单纯固定剂

1.福尔马林

2.乙醇

3.丙酮

4.氯化汞

5.重铬酸钾

6.铬酸

7.苦味酸

8.锇酸

9.醋酸10.三氯醋酸

固定液的分类

混合固定剂

1.甲醛混合固定液

2.酒精混合固定液

3.丙酮混合固定液

4.氯化汞混合固定液

5.重铬酸钾混合固定液

6.铬酸混合固定液

7.锇酸混合固定液

8.苦味酸混合固定液

9.三氯醋酸混合固定液四、组织冲洗、脱水与透明

（一）组织冲洗

1.简易流水冲洗法

2.一列式玻瓶或水槽冲洗法

3.倒置冲洗法

4.酒精洗涤法

组织与酒精1：20 12～24小时50%~70%酒精，更换3~6次，每4小时更换一次，可在70％酒精中较长时间保存

（二）组织脱水 1.脱水剂乙醇丙酮正丁醇二氧氯环 2.脱水方法

（三）组织透明1.二甲苯2.甲苯3.苯4.香柏油5.三氯甲烷（氯仿）6.安妮林油

五、组织浸蜡与包埋

（一）浸蜡软蜡：熔点：45～54℃硬蜡：熔点：56～58℃，60～62℃（包埋）（二）包埋 1.石蜡包埋操作过程制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋。

2.石蜡包埋注意事项

1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60C左右。

2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。

另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。

3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。

4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。

5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。

6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。

7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。

8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。

六、组织切片1.石蜡切片法2.火棉胶切片法3.冰冻切片法

七、染料与染色

（一）染色简史

（二）染料分类1.天然染料苏木精胭脂红（卡红）地衣红2.人工合成染料