农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
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农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
转化农杆菌：
GV3101农杆菌感受态从-80℃取出，冰上融化，加入2-5ul质粒，去郭老师实验室电激转化（拿杯，洗，，吹干，预冷，加菌液，对准方向插杯，AAgr程序，激完后看时间2.2hv、5.0s 左右，每次需确定程序，需带的东西：镊子、枪、枪头、吹风机、纸、水、废液缸），激后往杯中加入200ul不含抗生素的LB，28℃，200rpm复苏30-60min，之后在含50mg/l Kan （1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、50mg/llRif（1/200，10mg/ml）的LB选择平板上涂板，在28℃培养箱中培养2天（1天可见微小单克隆），挑单克隆划板，28℃培养箱中培养2天。
预摇：
挑单克隆至30ml 含50mg/l Kan（1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、25mg/llRif（1/400，10mg/ml）的LB 中，28℃，200rpm，24h。
扩培：
以1：100扩培至含400ml的1L锥形瓶中，在28℃，200rpm培养13-16h（从冰箱中取出的菌扩培会慢些一般需要16h），至OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件5000rpm，8min。
转化植株：
转化前一天晚上或是转化当天剪去植株上所有果荚和露白的花
配制5%的蔗糖溶液（每种500ml），用少量蔗糖溶液摇悬起菌，在转化前再加入0.02%的Silwet L-77。将植株茎部浸泡在菌液中50s，取出略甩一下后，放入透明塑料袋中，密封保湿。所有转化完后，扣上黑色塑料袋和盒子，避光培养24h。一天后，将植株直立放置，浇水培养，3天1次，保证植株水分充足。过一周后进行再一次转化。
zqy
2009-5-7