不同渗透胁迫条件下脯氨酸含量的测定

一：实验课题名称

不同渗透胁迫条件下脯氨酸含量的测定

——不同浓度甘露醇处理二：选题背景或文献综述

植物细胞在遭受逆境胁迫时都会大量积累脯氨酸，起着保护植

物免受渗透胁迫伤害的作用。脯氨酸作为一种渗透调节物质，优先储存在植物液泡中，在细胞受到渗透胁迫时将脯氨酸运输到细胞

质中，通过增大细胞质浓度降低渗透势，使细胞在低渗透势条件下仍能吸收胞外水分，从而保持细胞原生质与外界环境的渗透平衡[7]。脯氨酸是所有氨基酸中水溶性最强的一种氨基酸，具有较强的水合能力。在植物受害时，脯氨酸会与蛋白质相互作用形成疏水骨架，以此来稳定和保护生物大分子和细胞膜结构。据H amilton 等.研究发现，脯氨酸具有保护盐胁迫下植物根部线粒体电子传递链复合体Ⅱ免受伤害的功能，通过维持光合活性而起到保护作用。脯氨酸也是多种自由基的清除剂。脯氨酸清除活性氧有两种机制：一种通过专一的螯合单线态氧和羟自由基，减轻胁迫所造成的氧伤害.【1】汤章城. 逆境条件下植物脯氨酸的积累及可能的意义

[ J] . 植物生理学通讯, 19 84, 20 ( 3) : 51 54.

【2】MM.A R ap id S ensitive T echnique o f D e ter mina t ion P rote in

c o n cen trat ion [ J ] .A n al 197 6, 7 2: 248 254.

[3] Roosens NHCJ, ThuTT, Iskandar HM, et al.Isolation of ornithine-δ-aminotransferasecDNA and effect of salt stress on its expression in Arabidopsis[J]. Plant Physiol,1998,117:263-271. [4]Delauney A J,Hu CAA, Kishor PBK, et al.Cloning of ornithine-aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by trans-complementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis[J]. J Biol Chem,1993,268:18673-18678. 【5】《植物生理学》（高等教育出版社第六版）潘瑞炽主编【6】《植物生理学实验指导》（高等教育出版社第四版）张志良等【7】叶乃器介绍实验中的点滴经验植物生理学通讯，1956，（3）：36.

三：实验目的和要求

1、学会常用实验材料的培养及处理；

2、掌握植物脯氨酸含量的测定方法；

3、掌握常用实验仪器的使用操作及提高实验动手能力；

4、学会文献的查阅与整理，熟悉实验设计的一般原则、方法步骤，

提高自己的实验设计能力、操作能力、独立分析问题、解决问题能力和综合运用能力。

四：实验内容及其条件

实验内容：

1、实验植物种子的处理及幼苗的培养；

2、不同渗透胁迫条件下的胁迫处理；

3、脯氨酸含量的测定。

条件：

1、仪器：恒温培养箱、722型分光光度计、恒温水浴锅、

恒温恒湿光照培养箱、烧杯、移液管。

2.试剂：冰醋酸，3%磺基水杨酸，标准脯氨酸溶液，酸性茚三酮试剂。

五：实验原理与方法

当植物遭受渗透胁迫，造成生理性缺水，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植株内的水分状况。所以其含量可作为植物缺水的参考指标。在酸性条件下，茚三酮与脯氨酸反应生成红色化合物。其含量与色度成正比，故可用分光光度计测定。

六：实验步骤设计或实验方案

（一）标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液1.0，2.0，3.0 ，4.0 ，5.0及6.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为2，4，6，8，10μg/ml

（3）取5支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液，加入2ml蒸馏水，2ml 3%磺基水杨酸、2ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中显色1h。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置分层，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯（红色甲苯相）溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）

而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线。

（二）含量测定

.取地上部材料0.5g剪碎后，加5ml 3%磺基水杨酸研磨，匀浆移至离心管，在沸水中提取10min，冷却至室温后，3000r/min离心10分钟，取上清液2ml，分别加蒸馏水2ml、冰醋酸2ml和2.5%茚三酮4ml，置于沸水浴显色1h。冷却后于520nm处比色。从标准曲线上查出脯氨酸含量。

七：实验数据的处理

八：实验结果与分析

标准曲线回归方程：y=0.01x

（x为脯氨酸浓度（ug/ml），y为520nm下测得的OD值）根据实验数据和标准曲线得到下表格

九：实验小结

1.选取实验材料时，应选生长较好的叶片，不可选用已枯死的叶片。且应避免选取发黄、发红的叶片，以免影响实验结果。

2. 茚三酮虽无色，但与蛋白质会发生显色反应，故使用时应小心避免与皮肤接触。

3. 制作标准曲线时，应用2ml蒸馏水+ 2ml 3%磺基水杨酸+2ml冰醋酸+4ml茚三酮比色。

4、在环境胁迫条件下，植物体的脯氨酸含量明显变化。