生化分析技术(一)--光谱分析

光谱分析（分光光度技术）

利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。

特点：灵敏、快速、简便。

是生物化学分析中最常用的分析技术。

分类：

（一）可见及紫外分光光度法

分光光度法的理论基础是朗伯-比尔定律。

mber-Beer定律：

A=k·b·c

A为吸光度

k—吸光系数

b—光径，单位：cm

c—溶液浓度，单位：g/L

2.摩尔吸光系数：在公式“A=k·b·c”中，当c=1mol/L，b=1cm时，则常数k可用ε表示。

3.比吸光系数：在公式“A=k·b·c”中，当c为百分浓度（w/v），b为1cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。

（二）原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。

在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。

常用的定量方法有：

标准曲线法、标准加入法、内标法。

1.标准曲线法

配制一系列浓度不同的标准溶液进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准

曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。

2.标准加入法

把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交于横轴，找出组分的对应浓度。优点是能够更好地消除样品基质效应的影响。

3.内标法

在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。

本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。

只适用于双通道型原子吸收分光光度计。

（三）荧光分析法（发射光谱分析法）

利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法。

在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称为发射光。

荧光分析法测定的是受光激发后所发射的荧光强弱。

（四）火焰光度法

火焰光度法是利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法。

样品中待测元素激发态原子的发射光强度I与该元素浓度C呈正比例关系，即I＝aC。式中a为常数，与样品组成、蒸发和激发过程有关。

火焰光度法通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。

（五）透射和散射光谱分析法

主要测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度，常用方法为比浊法，又可称为透射比浊法和散射比浊法。

临床上多用于对抗原或抗体的定量分析。