乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类

时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC 培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无

鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：

1.溶钙圈法：

利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →

挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS 培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯

种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

2.溴甲酚绿指示剂法：

培养基：MRS 培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。

二.菌种的分离筛选

1.培养基：

★麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX ）1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH 自然 （分离用）

★★牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐

温% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 % （分离用）

★番茄汁碳酸钙培养基：

酵母膏 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 mL PH （分离用）

葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13-

15g/L KH2PO4 L

MgSO 4 g/L MnSO 4 NaAC PH 蛋白胨 L 糖蜜 酵母膏 3-5g/L 玉米浆 L

KH2PO4 L MgSO 4 NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L

（发酵或种子培养基）

★★ MRS 培养基 （分离培养计数用）

蛋白胨 、牛肉膏 、 酵母膏 、 柠檬酸氢二铵 、

葡萄糖 、 吐温 80 、 乙酸钠 、 磷酸氢二钾 、硫酸镁 、硫酸锰 、琼脂 、 蒸馏

水1L, pH 。（分离培养基），当MRS 培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸

钙, 充分混匀,倒平板。

BCP 培养基（溴甲酚紫培养基）

乳糖 蛋白胨 酵母膏 ℅溴甲酚紫10ml 自来水1000ml （分离用）

BCG 牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g ，溶于50ml 水中，加入℅溴甲酚绿酒

精溶液， 20min 。另取琼脂，溶于50ml 水中，加酵母膏

溶解后调， Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，

倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

2.分离筛选：

富集培养：取（）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.

菌种分离纯化：

溶钙圈法：

富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12ml MRS培养基?或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。

性能测定：

乳酸菌定性试验：

不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃ 37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。

方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸，在加入

℅高锰酸钾约，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银

溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。